Wir erkennen an, Melissa Grunlan für hilfreiche Diskussionen über SAM-Bildung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Robert A. Welch Foundation (A-1585) unterstützt.

Vorbereitung der Reagenzien Bereiten PIPES-Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, eingestellt auf pH 6,8 mit KOH). Aliquotieren und lagern Glucose-Oxidase, Catalase und Glucose bei -70 ° C und Taxol bei -20 ° C nach den bestehenden Protokollen. 1,2 aliquotieren und lagern Tubulin bei -70 ° C gemäß den Anweisungen des Lieferanten enthalten. Pattern Au-Mikroelektroden mit Lithographie <ol><li> Cut Silizium-Wafern in 1 cm &#39;1,5 cm Substrate mittels eines Stifts oder einer Wafer-Cutter. Reinigen Sie die Substrate, indem man sie in ein Becherglas mit ausreichend Aceton um sie zu bedecken und beschallen für 5 Minuten. Ohne dass die Substrate, um zu trocknen, spülen Sie sie in frischem Aceton, dann sofort in Isopropanol und trocken mit Stickstoff zu spülen. </li><li> Fertigen Au Mikroelektroden auf der sauberen Substraten mit Standard-, Positiv-Ton Photolithographie oder Elektronenstrahl-Lithographie, abhängig von der Größe der gewünschten Funktionen. 3 Wenn der Gestaltung der Muster Geometrie, halten Sie die Durchmesser von jeder Elektrode Muster unter 100 Mikrometer, die Versorgung durch die gewährleistet PEG SAM (beschrieben im nächsten Abschnitt). Include Kontaktpads (~ 300 mm 2) positioniert 300 bis 500 mm aus dem Muster mit einem 1 mm Verbindungslinie der Pad mit der Elektrode (Abb. 1). Legen Sie die lithographische Muster in der Mitte des Substrats an Raum um das Muster für die Montage der Flusskammer ermöglichen. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Probengeometrie. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. </li><li> Nach der Entwicklung des Musters in der Lackschicht, kratz eine Zeile in der von der Kontaktstelle an den Rand des Substrates mit einer Pinzette (Abb. 1) zu widerstehen. Nach Metallabscheidung wird die Grund erlauben den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode und dem Rand des Substrates. Ein Abscheidekammer, vorzugsweise mit zwei Quellen, wird die Metallschicht zu hinterlegen. Die Elektroden sind durch Ablagerung von 2 nm von Cr (für die Adhäsion) von 6 nm Au gefolgt, ohne zu brechen Vakuum gebildet. Ein Quarzmikrowaage im Inneren der Kammer ausgestattet sind, können verwendet werden, um die Dicke der Folien während der Abscheidung zu messen. </li></ol> Bereiten Sie die SAM <ol><li> Vorheizen und Backofen in einem gut belüfteten Raum auf 75 ° C Bereiten Sie die Silanisierung Lösung durch Zugabe von 20 ml Toluol in einen 250 mL Becherglas. Dann fügen Sie 1 mL PEG-Silan (dh 5% v / v), um das Toluol mit einem Kunststoff-Pipette. Mix in der PEG-Silan gut durch Auf-und Abpipettieren von 5 bis 10 mal und dann unter Rühren mit der Pipette für 30 Sekunden. </li><li> Legen Sie die gemusterten Proben in das Becherglas mit der strukturierten Seite nach oben, um sicherzustellen, dass sie vollständig in der PEG-Silan-Toluol-Lösung getaucht und gleichmäßig über den Boden des Bechers angeordnet. Das Becherglas in den Ofen und backen 18 bis 21 Stunden bei 75 ° C. Während die SAM bildet, bereiten die Gegenelektrode (siehe unten) und montieren alle weiteren Komponenten für die verbleibenden Schritte erforderlich. </li><li> Nach 18-21 Stunden im Ofen, sollte das Toluol verdampfen Verlassen des gemusterten Proben in einer viskosen PEG-Silan-Rückstand. Fügen Sie 20 ml Toluol in das Becherglas und genießen die Proben für 1-2 Minuten. Entfernen Sie die Proben aus dem Becher und gründlich mit Toluol, dann Isopropanol und schließlich mit Stickstoff trocken. An diesem Punkt sollten die Proben sauber aussehen und die SAM-Schicht sollte unsichtbar für das bloße Auge. SAMs vorbereitet auf diese Weise sind nutzbar für bis zu zwei Tagen, wenn sie unter kühlen und trockenen Bedingungen (25 ° C, mäßiger Luftfeuchtigkeit) gelagert. Erfolglose SAM-Bildung entsteht eine trübe oder unebenen hued Rückstände auf der Oberfläche. </li></ol> Herstellung der Gegenelektrode In der gleichen Abscheidekammer Setup für Mikroelektroden Abscheidung verwendet, um eine Gegenelektrode durch die Hinterlegung von 1 nm Cr, um 4 nm Au auf einer 22 x 50 mm Nr. 1 oder Nr. 0 Deckglas gefolgt. Die Gegenelektrode sollte fast transparent mit einem hellgrauen oder rosa Färbung. Bewahren Sie die Gegenelektrode beschichtet-side-up in einer Petrischale, um es sauber zu halten. Polymerisieren Tubulin in MTs <ol><li> Thaw unmarkiertem Tubulin und Rhodamin Tubulin und sofort bei einem Verhältnis von 1:2 markiert, um unmarkierte zu hell MTs erhalten kombinieren. Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Polymerisieren die Tubulin für 20-40 Minuten in einem beheizten Wasserbad bei 37 ° C. Die Länge des MTs größer sein wird für längere Polymerisationszeiten. Während die Tubulin-Polymerisation ist, bereiten Sie einen PIPES-Taxol-Puffer durch Zugabe von Taxol zu 20 mM in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit PIPES-Puffer. Mix der Taxol auch durch Auf-und Abpipettieren mehrmals und Vortexen, und dann den Schlauch in das beheizte Bad bei 37 ° C. Nach der Polymerisation verdünnen MTs von 1 / 100 in warmen Rohren-Taxol-Puffer und Schildvon Licht. MTs auf diese Weise vorbereitet wird länglich im Laufe der Zeit und zu bündeln, die durch weitere Verdünnung reduziert werden kann. </li><li> Bereiten Sie eine 10-Sauerstoffbindung Mischung (OS) durch die Kombination von 30 ml kaltem PIPES-Puffer (0-4 ° C), 5 ml 50% 2-Mercaptoethanol, 5 mL Glucose-Oxidase, 5 mL Katalase und 5 mL Glukose. 2 Die Glucose sollte letzte sein. Mix von Auf-und Abpipettieren 3-5 mal nach dem Hinzufügen jeder Komponente. Legen Sie die OS-Gemisch auf Eis, es bleibt für etwa 2 Stunden wirksam. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die MT Polymerisation erfolgreich war und dass die MTs sind unter mehreren Minuten Fluoreszenzanregung durch bildgebende die vorbereitete MTs mit 1x OS Mischung stabil. Für die Bildgebung der MTs auf diese Weise hergestellt werden, dass eine Anregung / Emission-Filter-Kombination eignet sich für Rhodaminfluoreszenz verwenden. Bestimmen Sie die besten Arbeitsbedingungen Verdünnung für die Bildgebung einzelnen Filamente durch weitere Verdünnung der MTs von 1 / 10 bis 1 / 100 mit Rohren Puffer und Bildgebung mit 1x OS mischen. </li><li> Bereiten Sie eine Flusskammer durch Einfügen einer großen (22 x 50 mm) und kleine (22 x 22 mm) Deckglas mit zwei Stücken doppelseitigem Klebeband angebracht 2-3 mm auseinander. Das Band wird einfach in Streifen, indem sie auf einen Objektträger und Schneiden mit einer Rasierklinge geschnitten. Führen Sie ein paar Mikroliter MTs in die Messzelle mit einer Mikropipette. Für hohe Vergrößerung Bildgebung kann lange Objektive für die Abbildung der oberen Fläche der Flusskammer erforderlich sein. Der Abstand vom Deckglas / Probenoberfläche auf die Oberseite der Flusskammer wird durch die Dicke des Bandes bestimmt und sollte 60-100 mm sein. </li></ol> Pattern MTs mittels Elektrophorese <ol><li> Bereiten Sie eine Elektrophoresekammer, indem man zwei dünne Streifen doppelseitiges Klebeband über die strukturierte, SAM-beschichteten Probe, so dass die Elektrode zwischen den Streifen mit dem Verbindungsweg senkrecht auf das Band (Abb. 2). Legen Sie die Gegenelektrode auf dem doppelseitigen Klebeband mit der metallenen Seite berühren Sie das Band, so dass die Kante der Probe Überhänge der Gegenelektrode um etwa 3 mm (Abb. 2). Cut mehrere 15 cm Länge der isolierten Kupfer-Lackdraht und Streifen 1 cm der Isolierung off der beiden Enden. Befestigen Sie einen Draht zu den exponierten Au Fläche des Substrats mit einem kleinen Tropfen Silber-Lackierung und gleichzeitig dafür Sorge zu vermeiden, einen elektrischen Kontakt mit der Gegenelektrode (dies kann mit einem Multimeter überprüft werden). Schließen Sie einen zweiten Draht zur Gegenelektrode mit Silberfarbe. Drähte mit Silberfarbe befestigt werden weiter zu den Proben mit Klebeband befestigt werden. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Durchfluss-Modul für eine invertierte Fluoreszenzmikroskop. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. </li><li> Einführung MTs in der gewünschten Verdünnung mit Pipes-Puffer mit OS auf 1x Endkonzentration kombiniert. Bild in 20-facher Vergrößerung und suchen Sie das Muster auf den Silizium-Wafer vor dem Anlegen einer Spannung. Optional kann der Strömungsraum abgedichtet mit Nagellack Strömungs-und MT Migration in der Ebene der Flusskammer zu verhindern. </li><li> Tragen Sie eine Spannung von bis zu 1 V und beobachten die Migration von MTs. Niedrigere Spannungen (bis etwa 0,5 V) verwendet werden, wenn reversible Überfüllung von MTs erwünscht ist, aber dies erfordert Abdichtung der Flusskammer zur seitlichen Drift zu verhindern. Nagellack funktioniert gut für die Abdichtung der offenen Enden der Flusskammer. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0.7 V, können einige MT Haftung auf das Muster gesehen werden, obwohl es wird schwach sein. Bei Spannungen oberhalb von etwa 0,9 V, wird das MT-Migrations schneller sein, und die Haftung stärker sein wird. Oberhalb von etwa 1,2 V die Wahrscheinlichkeit für die Induktion Elektrolyse (Gasblasenbildung) und auch für die Zerstörung der Mikroelektroden deutlich erhöht. Migration kann durch Einstellen der vertikalen Ebene der Fokus des Mikroskops verfolgt werden. Wenn richtig ausgeführt, wird die MTs an die Oberfläche der Elektroden lokalisiert werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Rai-Choudhury, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. , (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Migration von MTS ist einfach visualisiert mittels Fluoreszenz-Mikroskopie aufgrund ihrer Helligkeit und der geringe Hintergrundfluoreszenz. Die Methode ist allgemein anwendbar auf Biomolekül Strukturierung, wie es verlangt nur, dass die Biomoleküle bewogen, eine Nettoladung durch eine geeignete Einstellung des pH tragen. Elektroosmose ist in dieser Konfiguration zu vermeiden, weil es keine geladenen Oberflächen wie z. B. die Kieselsäure Wände in der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden. <p class="jove_...

Nr. 1 Borosilikatglas Deckgläser (22 X 50 mm) wurden von VWR erworben. Polierte electronic grade p-Typ &lt;111&gt; Silizium-Wafer wurden von Addison Engineering, Inc. erworben Hochreine Silberfarbe von Structure Probe, Inc. (Katalog # 5001 AB) erhalten. Isolierte Feinstrick Kupfer Lackdraht (~ 0,08 mm (0,003) Durchmesser) können von der elektronischen Zulieferunternehmen bezogen werden.

antifouling self-assembled monolayers on microelectrodes for patterning biomolecules

Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (ethylenglycol) (PEG) trimethoxysilan selbstorganisierten Monoschicht (SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einer einzigen Versammlung Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die SAM ist die Beschichtung Mikroelektroden mit Standard-, Positiv-Ton-Lithographie strukturiert werden. Mit der Mikrotubuli als Beispiel verwenden wir eine Gleichspannung an elektrophoretische Migration auf die SAM-beschichteten Elektrode in einer reversiblen Weise zu induzieren. Eine Flusskammer ist für die Bildgebung der elektrophoretischen Migration und Mikrotubuli-Strukturierung eingesetzt<em&gt; In situ</em&gt; Mit Epifluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ist allgemein anwendbar auf Biomolekül Strukturierung, wie es Elektrophorese verwendet, um Zielmoleküle immobilisieren und erfordert daher keine spezifische molekulare Wechselwirkungen. Darüber hinaus vermeidet es Probleme beim Versuch, Muster der SAM-Moleküle direkt mit lithographischen Techniken. Die Kompatibilität mit Elektronenstrahl-Lithographie ermöglicht diese Methode, um Muster von Biomolekülen im Nanometerbereich eingesetzt werden.

Watch this Scientific Journal Video about Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules at JoVE.com

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.

Antifouling Selbstorganisierte Monoschichten auf Mikroelektroden für die Strukturierung von Biomolekülen

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

antifouling-self-assembled-monolayers-on-microelectrodes-for

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Aufrufe.  Texas A&M University (TAMU). Wir präsentieren ein Verfahren zur Bildung eines Poly (Ethylenglycol) selbstorganisierte Monoschicht (PEG-SAM) auf einem Silizium-Substrat mit Gold-Mikroelektroden. Die PEG-SAM ist in einem einzigen Schritt gebildet und verhindert Biofouling auf Silizium-und Goldoberflächen. Die Elektrophorese wird dann für die Strukturierung von Biomolekülen bis in den Nanobereich eingesetzt.

Serie: Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Patterning Cells on Optically Transparent Indium Tin Oxide Electrodes

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular constructs serving as in vitro mimics of native tissues.  In this study, photolithography and wet etching techniques were used to fabricate individually addressable indium tin oxide (ITO) electrodes on glass substrates.  The glass substrates containing ITO microelectrodes were modified with poly(ethylene glycol) (PEG) silane to make them protein and cell resistive.  Presence of insulating PEG molecules on the electrode surface was verified by cyclic voltammetry employing potassium ferricyanide as a redox reporter molecule.  Importantly, the application of reductive potential caused desorption of the PEG layer, resulting in regeneration of the conductive electrode surface and appearance of typical ferricyanide redox peaks.    Application of reductive potential also corresponded to switching of ITO electrode properties from cell non-adhesive to cell-adhesive. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.  Micropatterning of several cell types was demonstrated on these substrates.   In the future, the control of the biointerfacial properties afforded by this method will allow to engineer cellular microenvironments through the assembly of three or more cell types into a precise geometric configuration on an optically transparent substrate.

Non-fouling PEG silane monolayer was desorbed from individually addressable ITO electrodes on glass by application of a reductive potential. Electrochemical stripping of PEG-silane layer from ITO microelectrodes allowed for cell adhesion to take place in a spatially defined fashion, with cellular patterns corresponding closely to electrode patterns.

Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

The ability to exercise precise spatial and temporal control over cell-surface interactions is an important prerequisite to the assembly of multi-cellular ...

Forschung

Biologie

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...