We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Messung Pufferkraft in einer extrazellulären Flux Instrument: Zwei Variationen HINWEIS: Die Berechnungen und hier beschriebenen Methoden wurden unter Verwendung eines extrazellulären Flux Analyzer entwickelt. Für andere Instrumente, muss das Messvolumen entsprechend skaliert werden. <ol><li> Bereiten 0,1 M Standard HCl in Wasser unter Verwendung von HCl-Konzentrat (siehe Materialien und Ausrüstung) gemäß Herstelleranweisungen. Hinweis: Ein Berechnungsbeispiel für die Herstellung HCl Injektionen zur Verwendung bei allen vier Einspritzöffnungen sind in Tabelle 1 gezeigt: </li></ol><img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tabelle 1 Fortlaufende HCl-Injektionen in einer extrazellulären Flux Assay gut. <ol start="2"><li> Verdünnungen des HCl-Standard in dem Medium wie in Tabelle 1 für die Anzahl der Wiederholungsversuche technischen wobei Carr getestet werdenied in eine Platte, plus ein bis zum Pipettieren Fehler erlauben, zB für vier technische Replikate des Hafens A Injektion, bereiten Sie einen Vorrat an (1,1 &amp; mgr; x 5) 0,1 M HCl in (48,9 &amp; mgr; x 5) Assay-Medium. </li><li> Verteilen 50 ul in jeden Port A der Meßsonde Patrone. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Ports B, C und D. </li><li> Führen Sie einen extrazellulären Flux Assay 10 mit einem Standard-Kalibrierungszyklus, gefolgt von zwei Zyklen der [2 min mix, 1 min Wartezeit, und 5 min Mess] für jede der Vier-Port-Erweiterungen (siehe Abbildung 2). <ol><li> Programmieren Sie das Experiment oben in der Gerätesoftware nach Software-Anweisungen. Laden der vorbereiteten Kartusche in das Gerät und führen Sie die Kalibrierung nach Software-Anweisungen. </li><li> Wenn durch das Programm dazu aufgefordert werden, entfernen Sie die Kalibrierungshaltigen Platte und setzen Sie die Platte mit Assay-Medium in jeder Vertiefung in das Gerät; Programm fortsetzen. </li></ol></li><li> U<html> singen die durchschnittlich 8-10 Datenpunkte in einem stabilen Zustand erhalten (in der Regel die letzten 8-10 Punkte) vor und nach jedem Hafen hinaus errechnen (kumulativ) Unterschied in der pH-Wert (&amp; Dgr; pH) nach jeder Injektion von Standard-Säure verursacht. </li><li> Plotten ApH gegen nmol H + in der 7-ul-Volumen von der Messsonde eingeschlossen enthalten. Die lineare Steigung ist die Pufferkraft (BP) in mph / pmol H +. </li><li> Alternativ zu den Schritten von 1,2 bis 1,3, die Durchführung der &amp; Dgr; pH-Messungen nach einem Test, bei dem Anschlüsse A, B, und C für ein Experiment verwendet wird, gefolgt von einer HCl-Injektion in Port D. Wie in Tabelle 2 sind vier technische Replikate verwendet, um jeden Punkt eines 5-Punkt-Standardkurve in den 20 Versuchsbrunnen (mit Ausnahme der vier Hintergrundtemperaturkorrektur Wells) der extrazellulären Flussassayplatte zu erzeugen. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tabelle 2. Einzel HCl-Injektion in einer extrazellulären Flux Assay gut. 2. Mess Buffering Strom Verwenden eines externen pH Meter HINWEIS: Für die Messung der Pufferkraft eines Mediums unter Verwendung eines externen pH-Sonde, Kalibrierung der Sonde bei 37 ° C und diese Temperatur für alle Reagenzien während des Experiments aufrechtzuerhalten. <ol><li> Bereiten 0,1 M Standard HCl in Wasser unter Verwendung von HCl-Konzentrat nach Herstelleranweisungen. </li><li> Warm pH-Sonde, pH-Standards, dem Testmedium, dessen Pufferkraft zu messen ist, und 0,1 M HCl auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Kalibrieren pH-Sonde bei 37 ° C gemäß den Herstelleranweisungen. Pflegen Sie alle Reagenzien bei 37 ° C während des Assay durch Verwendung einer Wärmeplatte oder Wasserbad. </li><li> 10 ml Aliquot des Assaymediums in einem kleinen Becher oder konischen Rohr. Überwachen pH kontinuierlich mit Hilfe eines pH-Sonde eingetaucht. </li><li> Mit 0,1 M HCl zu dem alssagen Medium in 10-20 ul Aliquots. <ol><li> Stellen Sie sicher, das Mischen unter Verwendung eines Rührstabes oder durch den Behälter nach jeder Säureadditions manuell wirbeln. </li><li> Lassen Sie ein paar Sekunden, bis der pH-Wert-Messung zu stabilisieren, dann notieren Sie die pH nach jeder Zugabe. </li><li> Wie in Tabelle 3 gezeigt, stellen Sie eine ausreichende Anzahl von Ergänzungen genaue Steigungsberechnung zu gewährleisten und die pH-Bereich während des Experiments erwartet decken. </li></ol></li></ol><img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tabelle 3. Messpufferkraft mit einem pH-Meter. Die Daten stellen einen typischen Versuch mit sechs 20 ul Zugaben von 0,1 M HCl. <ol start="6"><li> Pro 7 ul Plot ApH gegen nmol H + zugegeben, was eine lineare Steigung, die die Pufferleistung (Abbildung 1) darstellt. </li></ol> Abbildung 1. Bestimmung Pufferkraft. HCl-Standardkurve, wie in Tabelle 1, Tabelle 2 oder (hier) gemessen, wie in Tabelle 3. Die Steigung der linearen Kurvenanpassung gibt die Pufferkraft (pH / nmol H + in 7 ul). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SEM von n = 9 technische Replikate. <ol start="7"><li> Sobald die Pufferkraft wird durch Methode 1 oder 2 oben genannt, wandeln die ECAR Signal (mph / min), um PPR (pmol H + / min / ug Protein) durch Division ECAR durch Puffern Leistung (BP) (mph / pmol H +) und Skalieren auf den Proteingehalt jedes Wells: PPR tot (pmol H + / min / ug Protein) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + in 7 ul) / Protein pro Well (ug) Gleichung 6 </li><li> Alternativ können Sie die gleichen Experimente in der Methodes 1 oder 2, um die Pufferkapazität (BC) Wert von der Gerätesoftware verwendet werden, um während der Datenerfassung automatisch berechnen PPR berechnen. HINWEIS: Das Gerät Bedienungsanleitung 12 (Seite 107) liefert detaillierte Informationen über die Ermittlung und Verwendung Pufferkapazität, in BC ist, wie beschrieben, BC (mol / L) = mol H + / (&amp; Dgr; pH x Puffervolumen (L)) Gleichung 7 HINWEIS: Die Pufferkapazität, wie in Gleichung 7 definiert ist, kann in den oben beschriebenen Instrument oder externen pH-Sonden-Assays berechnet werden. Konvertierung zwischen Pufferkraft und Pufferkapazität ist leicht getan (siehe beigefügte Tabelle): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + in 7 ul) / 7 ul) Gleichung 8 HINWEIS: Wenn bekannt ist vor der Durchführung des Assays kann die Pufferkapazität direkt in der Gerätesoftware im Versuchsaufbau eingegeben werden. </li><li>Wenden Sie dieses Verfahren und die oben zu den meisten herkömmlichen Puffersystemen verwendet werden, Berechnungen, wie in früheren Veröffentlichung 6 beschrieben. HINWEIS: In Tabelle 4 sind die Pufferkraft und die Pufferkapazität von mehreren herkömmlichen Medien. </li></ol><img alt="Tabelle 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tabelle 4. Buffering Macht und Pufferkapazität des ausgewählten Medien. 3. Durchführen einer Extracellular Flux Assay unter Verwendung von C2C12 Myoblastenzellen HINWEIS: In Schritt 3.4.3, gab es keine Unterschiede in der beobachteten CO 2 abgeleitetes Säureproduktion von der Gegenwart von Carboanhydrase in C2C12-Kultur, was darauf hindeutet, dass seine Anwesenheit nicht zur vollständigen Umwandlung von CO 2 und HCO 3 erforderlich - + H +. Jedoch empirisch testen diese in verschiedenen Versuchssystemen vor om empfohlenitting Carboanhydrase. <ol><li> Kultur der Maus C2C12 Myoblasten 13 bei 37 ° C unter 95% Luft / 5% CO 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 11,1 mM Glucose, 2 mM Glutamin, 10% v / v fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> 24 Stunden vor dem Test, Platte / Samenzellen in 100 ul des gleichen Kulturmediums bei 20.000 Zellen / Vertiefung in eine 24-Well-Polystyrol extrazellulären Flussassayplatte (siehe Materialien und Verfahren) ohne zusätzliche Beschichtung. </li><li> Verdünnter Oligomycin, FCCP und Rotenon zuzüglich Myxothiazol und HCl (optional) zu 10X Endkonzentration in Krebs-Ringer-Phosphat-HEPES (KRPH) Assay-Medium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH 2 PO 4, 3,7 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 0,1% w / v fettsäurefreies Rinderserumalbumin, pH 7,4 bei 37 ° C). </li><li> Zellpräparation <ol><li> 30 min vor dem Test, waschen anhaftenden Zellen dreimal durch Ansaugen an GEntly entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und dann langsame Zugabe von 500 ul KRPH. </li><li> Inkubieren Zellen nach dem dritten Waschschritt bei 37 ° C unter Luft (nicht unter 5% CO 2, die den pH-Wert dieser Bicarbonat-freiem Medium verändert wird). </li><li> Bei Testbeginn, ersetzen KRPH in Vertiefungen mit 500 ul frisches KRPH mit 500 U / ml Carboanhydrase und entweder Glucose (10 mM) oder nur Medium, ohne zusätzliches Substrat. </li></ol></li><li> Laden der Sensorkartusche <ol><li> Pipettieren Sie 50 ul Aliquots jeder 10x Verbindung in Schritt 3.3 in Patrone Häfen von einer extrazellulären Flusssensorkartusche wie folgt (Endkonzentrationen im Test auch angegeben) hergestellt: Port A: 2 ug / ml Oligomycin, Port B: 0,5 um FCCP, Port C : 1 &amp; mgr; M Rotenon, 1 uM Myxothiazol, Port D: HCl (falls die Durchführung einer Assay Säure Kalibrierung wie oben und in Tabelle 2 beschrieben). Hinweis: Für die Zwecke der vollständigen Atmungskette Hemmung hier beschriebenen, 1 uM meinexothiazol austauschbar mit 1 &amp; mgr; M Antimycin A. verwendet werden </li></ol></li><li> Extracellular Flux Assay: <ol><li> Führen Sie eine Standard-extrazellulären Flux Assay zur Bestimmung der Atemkontrolle, wie in 10 beschrieben. </li></ol></li></ol> HINWEIS: Für jedes Segment des Experiments bestimmen die Mischung, zu warten, und Messzeiten gewünscht, sowie die Anzahl der Zyklen pro Segment. Anmerkung: Die Daten in der Tabelle 5 wurden zwei Testzyklen von 2 min mischen, 1 Minute Wartezeit, und 5 min Maß für jedes Segment gesammelt, mit drei Testzyklen nach dem Port D Zugabe unterschiedlicher Mengen an HCl (zur Kalibrierung von Zwischenspeichern, Computer wie in Tabelle 2). <img alt="Tabelle 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tabelle 5. Extracellular Flux Assay-Konfiguration. 4. Measuring End-Punkt-Laktat-Konzentration HINWEIS: Um die in irgendeiner anderen System, Endpunkt Laktatkonzentration am Ende einer extrazellulären Fluss Experiment kann direkt in einem konventionellen 96-Well-Platte bestimmt werden hier beschriebenen indirekten Assay durch Messung der Anfangsgeschwindigkeit (mehr als 2 min) der Reduktion der Validierung NAD + → NADH von Laktat-Dehydrogenase, die im Detail in unserer früheren Veröffentlichung 6 beschrieben katalysiert. Für die in Repräsentative Ergebnisse präsentierten Daten wurde der Endpunkt Laktatkonzentration in glucosehaltigen Testvertiefungen betrug etwa 40 um. <ol><li> Vorbereitung 2x Hydrazin Medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM Hydrazin, pH 9,8 bei 22 ° C). Unmittelbar vor dem Test zu starten, fügen NAD + bis 4 mm und Laktat-Dehydrogenase (LDH) bis 40 U / ml. Endgültige Assaymedium Zusammensetzung (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM Hydrazin, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. </li><li> Unmittelbar nach der extrazellulären Flux Assay, entfernen 100ul Assay-Medium von jeder Vertiefung der extrazellulären Flussassayplatte und in ein Well einer opak (schwarz) 96-Well-Platte. </li><li> Zu jeder Probe gut, fügen Sie 100 ul 2x Hydrazin Medium. </li><li> Die Platte in einem Mikroplattenleser sofort zu laden und beginnen Überwachung NADH Fluoreszenz bei 340 nm Anregung / 460 nm Emission. </li><li> Nehmen Sie die Anfangsgeschwindigkeit für ca. 2 min. </li><li> Führen Sie einen ähnlichen Versuch, um eine Standardkurve, bei der Anfangsgeschwindigkeit gegen die Laktatkonzentration für zusätzlichen Laktatkonzentrationen von 0 bis 50 &amp; mgr; M zu konstruieren. </li><li> Berechnen Laktatkonzentration in jedem Versuchs auch mit Hilfe der Standardkurve. </li></ol> 5. Mess Protein Inhalt <ol><li> Entfernen Sie verbleibende Testmedium aus jeder Vertiefung der Testplatte. </li><li> Dreimal mit 250 Wash Brunnen ul BSA freie KRPH, wobei Sie darauf achten, die eine Verlagerung der Zellen vom Boden und Oberfläche zu minimieren. </li><li> In 25 ul RIPA LyseMedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v Natriumdeoxycholat, 0,1% v / v SDS, pH 7,4, bei 22 ° C) zu jeder Vertiefung der Testplatte. </li><li> Inkubieren Platte auf Eis für 30 min. </li><li> Agitieren Platte auf einem Plattenschüttler bei 1200 rpm für 5 min. </li><li> Messung der Proteinkonzentration durch Standardverfahren, beispielsweise durch BCA-Assay, um sicherzustellen, dass der Lysepuffer Zusammensetzung mit dem Messverfahren kompatibel ist. Der Proteingehalt in dem Experiment in 2 betrug ~ 4 &amp; mgr; g / Vertiefung. </li></ol>

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Dr. Shona Mookerjee erklärt, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Dr. Martin Marke für Seahorse Biosciences, die Instrumente und Reagenzien in diesem Artikel verwendete produziert konsultiert. Open Access Kosten für diesen Artikel wurden von Seahorse Biosciences gezahlt.

Extrazelluläre Ansäuerung ist eine leicht gemessen Angabe der zellulären Stoffwechselrate. Um richtig bestimmen die Rate der zellulären Glykolyse (wie durch Laktatproduktion definiert) ist es wichtig, die Pufferleistung der Testmedium kennen und an die extrazelluläre Flussmessungen des Sauerstoffverbrauchs und Versauerung zu konvertieren, um die Produktionsraten Proton. Mit der Durchführung dieser Berechnung kann die Versauerung von CO 2 in der Zitronensäurezyklus freigesetzt resultierenden abgezogen werden, so dass die Versauerung, die von Laktatproduktion führt. Die mehreren verschiedenen Möglichkeiten die hier angegeben, um Pufferkraft für diese Korrektur messen tragen unterschiedliche Vor- und Nachteile. Externe Messung unter Verwendung einer pH-Sonde ist sehr genau und reproduzierbar ist, kann jedoch kleine Unterschiede im pH-Erfassung durch die in der Testplatte, die Zugabe von Verbindungen, die während des Tests, oder der Anwesenheit von t enthaltenen Fluorophore eingeführt widerspiegelner Zellen selbst. Die in-Platte pH-Messungen diese Probleme anzugehen, sondern auch die Einführung in unterschiedlichem Maße von experimentellen Lärm. Die CO 2 Korrektur ECAR ermöglicht zum ersten Mal die eindeutige quantitative Berechnung der glykolytischen Rate und zeigt Unterschiede in respiratorische und glykolytische Beitrag zur gesamten ECAR im Verlauf eines Experiments. Unter Verwendung von Gleichung 5 und die Messungen der OCR, ECAR und Pufferung Leistung kann glykolytischen Rate mit der einfachen Tabellenkalkulation zur Verfügung gestellt (Tabelle 6) berechnet werden. Diese Rate kann durch post-hoc Laktatmessung, falls gewünscht 6 überprüft werden. In Zellen, in denen die Pentosephosphatweg hoch aktiv ist, kann die Verwendung von Pathway-Inhibitoren wie 6-Aminonicotinamid sinnvoll sein, die glycolytische Rate zu isolieren. Berechnung der Beiträge sowohl von CO 2 - und Lactat abgeleitete H + aus dem gesamten gemessenen extrazelluläre Ansäuerung Frequenz und Sauerstoff ConsumptIonen-Rate ist ein unschätzbares Werkzeug für die Verwendung von extrazellulären Flussdaten, um leistungsfähige und quantitative Aussagen über Stoffwechselaktivität zu machen. Mit den hier beschriebenen Verfahren, einschließlich verschiedene Modifikationen zur Messung Pufferkraft und die Optimierung der für die extrazelluläre Flussexperiment für die untersuchten Zellen und die gewünschten Daten, kann die Geschwindigkeit der Glykolyse in intakten Zellen, die unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist auf Zellen, die in adhärenten Kultur auf wachsen kann (oder die Zellen oder Organellen, die geklebt werden können, um) ein Polystyroloberfläche begrenzt. Es ist sehr zuverlässig, wenn die kultivierten Zellen homogen und konfluent sind, obwohl Nutzdaten können noch über einen Bereich von diesen Bedingungen erhalten werden. Die Berechnungen erfordern einige Kenntnisse über den Stoffwechsel der Zellen, wie max H + / O 2 im Bereich von 0,65 bis 1,0 für die vollständige Oxidation von verschiedenen Substraten und zur Partialoxidation 6 jedoch, wenn die Zellen known um Glukose zu oxidieren, kann ein Wert von 1,0 ausgegangen werden. Wenn alle relevanten metabolischen Charakterisierung kann dieses Verfahren besonders nützlich sein, wenn sie in Systemen verwendet, bei dem eine Verschiebung zwischen der Atemwege und glykolytischen Metabolismus aufrechtzuerhalten zellulären ATP-Versorgung ist eine kritische Phänotyp, einschließlich der Charakterisierung von Stammzellen und tumorderivierten Krebszellen. Das Verständnis der Stoffwechseleinstellung Veränderungen in diesen und anderen Zusammenhängen wird ein höheres Maß an Kultiviertheit und Genauigkeit bei der Versuchsplanung und Analyse dieser Zelltypen ermöglichen.

Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Flussanalyse genau zu messen. Quantitative Messung der glykolytischen Rate unter Verwendung extrazelluläre Ansäuerung ist der gewünschte Endpunkt vieler Experimente. Allerdings ist die Gesamtrate der extrazellulären Ansäuerung die Summe aus zwei Komponenten: Atem Versauerung, in Form von CO 2 (die H 2 CO 3 distanziert dann zu HCO 3 Hydrate - + H +) und glykolytischen Versauerung, in Form Lactat - + H +. Die Beiträge der CO 2 zum Gesamtextrazelluläre Ansäuerung bis vor kurzem wurde als geringfügig in der Messplattform zum Einsatz, der XF24 Analysator 7. Es ist jedoch klar, in mehreren anderen Systemen, die CO 2 kann einen wichtigen Beitrag zur extrazellulären Ansäuerung 4-5 sein. Mehrere Papiere bestätigen diese conBeitrag, aber versuchen Sie nicht, direkte Quantifizierung von CO 2 abgeleitete Säure 3,8,9. Wir haben kürzlich gezeigt, dass quantitativ CO 2 Produktion ist eine bedeutende Quelle der extrazellulären Ansäuerung in diesem System 6. Darüber hinaus, obwohl es mehrere Stoffwechselwege, die CO 2 aus Glukose-Katabolismus zu erzeugen, die Kontrollen durch Matrix-Dehydrogenasen in der Zitronensäure-Zyklus durchgeführt werden die überwältigende Mitwirkenden und alle anderen Quellen zu erzeugen Mengen an CO 2, die innerhalb der Fehler 6. Ohne Korrektur für die CO 2 -Produktion ist extrazelluläre Ansäuerung daher eine mehrdeutige Indikator für glykolytische Rate und nicht quantitativ verwendet werden. Unsere früheren Veröffentlichung hebt mehrere Fälle, in denen Atmungs CO 2 umfasst den Großteil der Gesamt Ansäuerung Signal, sogar in einzelnen Zellen im Allgemeinen angenommen, dass in erster Linie nutzen Glykolyse 6. Zusätzlich kann dasAtem CO 2 Beitrag zur gesamten Ansäuerung variiert stark im Verlauf gemeinsamer metabolischer Profile Experimente zeigen, dass den genauen Vergleich der glykolytischen Rate während verschiedene Teile eines Experiment erfordert Korrektur für CO 2. Um den glykolytischen Rate von Zellen mit der extrazellulären Ansäuerung Rate der zu messen, ist es notwendig, den pH-Wert der Entwicklung der Gesamt H + erzeugt umzuwandeln und um die extrazellulären Ansäuerung von CO 2 verursacht wird während des Betriebs des Zitronensäurezyklus freigesetzt zu subtrahieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Messen extrazellulären Protonenproduktionsrate (von extrazellulären pH-Änderungen und der kalibrierten Pufferkraft des Assaymediums) und CO 2 -Produktion (von extrazellulärer Veränderungen in O 2 -Konzentration) und zeigen, wie man glykolytischen Rate zu berechnen unter Verwendung dieser Messungen. Diese Methode Stärke<html> ens die Nützlichkeit der extrazellulären Ansäuerung Messung, indem Sie es richtig zu berechnen glykolytischen Rate wie durch Laktatproduktion definiert. Ohne Korrektur für Atem CO 2 (oder direkte Messung der Laktat), ist es unmöglich, festzustellen, ob und in welchem ​​Umfang die Gesamt Ansäuerungsrate spiegelt glykolytischen Rate, verwechseln die Interpretation von Experimenten, die gesamte extrazelluläre Ansäuerung nutzen als direkte Messung der Laktatproduktion. BERECHNUNGEN CO 2 und Lactat sind, innerhalb des experimentellen Fehlers, die nur zwei Beiträge zur extrazellulären Säureproduktion, basierend auf Experimenten mit Myoblastenzellen 6. Daher kann die Rate der gesamten extrazellulären Ansäuerung (PPR, Protonenproduktionsrate) wie folgt definiert werden: PPR tot = PPR bzw. + PPR glyc Gleichung 1 . _content &quot;&gt; wobei tot = Gesamt; resp = Atem; glyc = glykolytischen glykolytischen PPR ist somit: PPR glyc = PPR tot - PPR bzw. Gleichung 2 Hier, PPR tot = ECAR tot / BP Gleichung 3 wo ECAR = extrazellulären Ansäuerungsrate (mph / min) und BP = Pufferkraft (mph / pmol H + in 7 ul), während PPR bzw. = (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / A-2) (OCR tot - OCR rot / myx) Gleichung 4 wobei K 1 = kombinierte Gleichgewichtskonstante der CO 2 Hydration und Dissoziation zu HCO 3 - + H +; max H + / O 2 = the CO 2 stammenden Versauerung für eine bestimmte metabolische Umwandlung, wie vollständige Oxidation von Glucose-6; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate (pmol O 2 / min) und OCR rot / myx = nicht-mitochondrialen OCR. Gleichung 4 Isolaten mitochondrialen OCR durch Subtrahieren jeden Nicht mitochondrialen OCR (definiert als OCR, die gegenüber der mitochondrialen Atmungsgifte Rotenon und Myxothiazol ist) und beträgt die maximale H + pro O 2 für jedes Substrat (max H + / O 2 verbraucht erzeugten ) (siehe 6), sowie der Anteil an CO 2, die zu H + in der Versuchstemperatur und pH-Wert (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1). Für eine vollständige Oxidation von Glucose, mitochondrialen Sauerstoff Verbrauchsrate (OCR) ist genau gleich der Geschwindigkeit der CO 2 -Produktion. Im geschlossenen Assayvolumen von extrazellulärem Flussmessung, CO 2 erzeugend durch Atmung bleibt gefangen in dem Testmedium. + H + - der größte Teil der eingefangenen CO 2 mit H 2 CO 3, die dann dissoziiert HCO 3 hydratisiert. Eine kleine Fraktion gelöst bleibt, jedoch nicht hydratisiert, und ein anderer kleiner Anteil hydratisiert, aber nicht gespalten, da thermodynamisch durch die kombinierte Gewichtskonstante CO 2 Hydratation und Dissoziation HCO 3 diktiert - + H + bei Versuchstemperatur (37 ° C) und pH- (~ 7,4). Somit ist die komplette Gleichung zur Berechnung PPR g durch Subtraktion PPR bzw. von PPR tot ist: PPR glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / A-2) (OCR tot - OCR rot / myx) Gleichung 5 ichn So Raten von Atmung und Glykolyse, sowie ihre zugehörigen ATP Produktionsraten kann quantitativ aus einfachen Messungen (Sauerstoffverbrauch, extrazelluläre Ansäuerung Pufferkapazität) sowie Ein- und Berechnung der anderen erforderlichen Werten (H + / O 2 bestimmt werden, P / O, und die Gleichgewichtskonstante K 1) 6. Das hier beschriebene Experiment baut auf Standard-Techniken für die Verwendung der extrazellulären Flux Analyzer wie Seahorse XF24 10,11; für andere extrazelluläre Flussmessung Formate (zB XF E 96 oder XFP), sollten alle unten Volumina entsprechend skaliert werden. Die Pufferleistung der Assay-Medium kann durch die Entwicklung einer Standard-Kurve entweder direkt in der extrazellulären Flussplattform oder separat mit einem kalibrierten pH-Sonde gemessen werden. Hier werden drei Optionen zur Messung von Puffern durch die extrazelluläre Flusstestmedium gegeben, einschließlich Verwendung aller INJEKTIERTan den Ports der extrazellulären Flux Analyzer mit zellfreien Probenvertiefungen oder nur mit dem letzten Einspritzöffnung in zellhaltigen Brunnen (Abschnitt 1) ​​oder durch Verwendung eines externen pH-Messung (Abschnitt 2). Siehe die beigefügte Tabelle für die vollständige Berechnung der Beispieldaten. Um Pufferkraft zu messen unter Verwendung des pH-Erfassungsfähigkeit der extrazellulären Flux Instruments, ist es am sichersten, zellfreien Brunnen verwenden, um Signaländerung zu minimieren. Innerhalb des Fehlers zwischen zellfreie und zellhaltigen Vertiefungen bei der Durchführung dieser Messung (Daten nicht gezeigt) besteht jedoch keine statistische Differenz. HINWEIS: Die in Schritt 1.7 beschriebenen Variante trägt den Vorteil, Buchhaltung für mögliche Änderungen an Puffern von zugesetzten Verbindungen oder durch die Anwesenheit von Zellen verliehen, mit dem Nachteil lauter Signal. Jedoch, wie oben angegeben, wurden keine signifikanten Unterschiede in der berechneten Pufferkraft zwischen dem zellfreien Design in Tabelle 1 gezeigt festgestellt unddie post-Versuchsplanung in der Tabelle 2 unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen. Zusätzlich über kleine ApH Bereichen (&lt;0,4 Einheiten; experimentell am besten, 0,2 Einheiten beschränkt), die lineare Steigung durch Auftragen Δ mph / pmol H erhaltenen + angemessen approximiert die logarithmische Beziehung zwischen &amp; Dgr; pH und [H +]. Die Steigung der Standardkurve stellt daher die Pufferkraft des Assaymediums prüfenden pH / nmol H + in 7 ul oder mph / pmol H + in 7 ul. Wir empfehlen Medium Pufferkraft erhöht oder verringert Zelldichte für die Proben, die einen pH-Wert von 0,2 Einheitsänderung während der Messzeit überschreiten. Die Messzeit kann auch herabgesetzt werden, aber dies kann die stationäre Ansäuerungsrate verkürzen und Fehler in die Ratenberechnungs einzuführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> Figur 2 zeigt die Rohdaten für ein typisches Experiment. Die letzten 10 Messpunkte von dem Punkt-zu-Punkt-Aufzeichnung sowohl von OCR und pH (schraffierte vertikale Balken) wurden für die Berechnungen verwendet. Anfängliche Bedenken, dass der Mittelwert (Mittelpunktmessung) jedes Testzyklus würde keine ausreichende Auflösung der Preis für eine genaue Berechnung, vor allem, da es schien, eine leichte Verzögerung zwischen Hafen hinaus und stationären Ansäuerungsrate zu können, wurden nicht bestätigt, dies scheint nicht wesentlich zur Berechnungsfehler tragen (nicht gezeigt). Alternativ kann, wenn der korrekte Pufferkapazität während des experimentellen Aufbaus eingegeben, PPR kann direkt von der Datenerfassungsinstrument Auslesen durch die Anzeige der Ausgabe PPR in der Gerätesoftware oder im PC-kompatiblen Format als eine der Datenausgabeeinstellungen verfügbar gelesen werden. ftp_upload / 53.464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Repräsentative extrazellulärem Fluss Spuren von O 2 und H +. OCR und pH-Spuren für das Beispiel Experiment in Tabelle 5, die 10 mM Glucose bei Assay beginnt. Port D hatten unterschiedliche HCl-Konzentrationen für die Kalibrierung des Pufferkraft (in diesen gemittelten Spuren gezeigt). Daten aus früheren Veröffentlichung 6. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SEM von n = 8 biologischen Replikaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Datenanalyse repräsentativer Ergebnisse Verwendung der in Tabelle 6 gezeigt und als Anlage vorgesehen Arbeitsblatt kann die Datenwerte aus den einzelnen Vertiefungen in den mit gelben Schriften dargestellt Spalten eingegeben werden. Alle sechs Spalten<html> der rechten Seite sind aus diesen Eingaben berechnet. Das Beispiel in Tabelle 6 zeigt die Berechnungen der PPR bzw. und PPR glyc Verwendung ECAR und OCR-Daten aus einzelnen Vertiefungen für die nativen Bedingungen mit oder ohne Zusatz von Glukose, vor dem Anschluss A Zugabe von Oligomycin. Technische Replikate für jedes biologische Herstellung sind in der Regel gemittelt, um einzelne Werte der Ausgänge in den letzten vier Spalten geben, dann werden die Daten aus unterschiedlichen biologischen Präparate mit entsprechenden Ausbreitung von Fehlerstatistiken in BP und dieser vier Werte gemittelt. <img alt="Tabelle 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tabelle 6. Berechnung der Atemwege und des glykolytischen Versauerung. Spalten in gelben Leitung anzuzeigen, Werte aus der Berechnung eingegeben werden (zB BP, max H + / A-2) oder von der Datenerfassung (zB ECAR tot, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Tabellenansicht |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle als Excel-Tabelle herunterladen .</a> Beiträge der Glykolyse und Atmung zu PPR nach der Korrektur Abbildung 3 zeigt die grafische Ausgabe von Daten für native Raten von glykolytischen und Atem Versauerung, Raten folgenden Oligomycin hinaus (Port A), und die Sätze folgende FCCP hinaus (Port B) berechnet, wie in Tabelle 6. Diese Daten zeigen deutlich, wie die Anteile der Atemwege und des glykolytischen Versauerung Wechsel mit Wahl des Substrats (Glukose vs. Kontrolle (CTL) mit keiner hinzugefügt) und mitochondrialen Status (native Funktion vs. pharmakologisch veränderten Funktion). &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Abbildung 3. Proton Produktionsrate (PPR) aus glykolytischen und Atemquellen. PPR von Atmung (offene Abschnitte) und Glykolyse (gefüllt Portionen) der C2C12-Zellen unter Verwendung der Gleichung 5 mit Zusatz von Glukose (drei linke Balken) oder ohne Zusatz von Glukose (drei rechte Balken). Daten von 6. Alle Daten repräsentieren den Mittelwert ± SEM von n = 8 biologischen Replikaten.

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Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Aufrufe.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Serie: Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Forschung

Biologie

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Die Messung der Kohlendioxidproduktion von Radiolabeled Substrate in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...