Bei diesem Protokoll handelt es sich um das autologe System zur humanen Fibroblastenkultur mit patienteneigenem plättchenreichem Plasma und einem standardisierten Präparat für fünf Minuten. PRP fördert eine massive Zellexpansion von Fibroblasten in Kultur. Ich würde Ihnen empfehlen, diese Methode mit PRP als Zellergänzung zu verwenden, wenn Sie eine massive und sichere Zellexpansion für autologe Zelltherapien benötigen.
Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, würde ich Ihnen empfehlen, die PRP-Integrität zu überprüfen. Ihr Plasma muss sehr sauber sein und keine roten Blutkörperchen enthalten. Wenn Sie es übertragen, müssen Sie es sehr sorgfältig tun.
Und was die Verdauung Ihres Gewebes betrifft, so muss es sehr sauber sein, bevor Sie fortfahren. Drehen Sie zunächst die mit Blut gefüllten Röhrchen mit plättchenreichem Plasma (PRP) dreimal vorsichtig auf den Kopf, um das Blut mit dem Gerinnungshemmer zu vermischen. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 1500 g fünf Minuten lang in einem festen, um 45 Grad abgewinkelten Rotor und balancieren Sie die Röhrchen aus.
Nach der Zentrifugation hat das fraktionierte Blut rote und weiße Blutkörperchen, die unter dem Trenngel und den Blutplättchen auf der Oberfläche des Gels eingeschlossen sind. Drehen Sie das PRP-Röhrchen 20 Mal vorsichtig um, um die Thrombozytenablagerung im Plasmaüberstand zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Blutplättchen vollständig vom Gel gelöst haben und das Plasma von klar und transparent zu trüb wechselt.
Sammeln Sie die Plasmalösung aus dem Röhrchen mit einer Transfervorrichtung, die an eine 10-Milliliter-Spritze angeschlossen ist. Geben Sie die Hautproben in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen mit PBS und schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig. Wenn die Hautprobe relativ groß ist, legen Sie sie mit der epidermalen Seite nach unten auf den Deckel einer 150 Quadratzentimeter großen Gewebekulturschale.
Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe mit einer Pinzette und einer Schere. Um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, spülen Sie das Gewebe alle paar Minuten in PBS aus. Wenn die Fettentfernung abgeschlossen ist, schneiden Sie die Hautproben mit einem Skalpell in etwa 0,5 x 1,5 Zentimeter große Streifen.
Als nächstes geben Sie fünf Milliliter Kollagenase/Dispase-Mischung in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie das geschnittene Gewebe in das Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Gewebestücke in die Lösung getaucht sind, und verschließen Sie das Röhrchen sicher.
Legen Sie die Röhrchen in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln für 150 Minuten. Nach der Inkubation wird das Röhrchen mit dem Gewebe in die Biosicherheitswerkbank gebracht. Stellen Sie den Deckel einer sterilen 100-Millimeter-Kulturschale verkehrt herum in die Biosicherheitswerkbank.
Übertragen Sie die Gewebesuspension ohne Spritzer auf den Boden der 100-Millimeter-Kulturschale. Wenn Gewebestücke im Röhrchen verbleiben, verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Pipette oder eine sterile Pinzette, um die Stücke auf den Boden der Kulturschale zu übertragen. Halten Sie die Dermis mit der Epidermis nach oben mit einer Pinzette.
Fassen Sie den Rand der Epidermis mit einer weiteren Pinzette und ziehen Sie die Dermis und die Epidermis auseinander. Bewahren Sie die getrennten Stücke auf demselben Deckel auf und legen Sie die Hautstücke in eine neue 100-Millimeter-Kulturschale, die PBS enthält. Anschließend werden die Hautstücke mit einer Laborzange in ein 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen übertragen, das drei Milliliter 0,3%Trypsin PBS enthält.
Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und mischen Sie den Inhalt alle zwei bis drei Minuten, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Stoppen Sie die Reaktion nach 10 bis 20 Minuten, indem Sie drei bis fünf Milliliter eiskaltes Nährmedium hinzufügen. Wirbeln Sie das Rohr mehrmals kräftig vor.
Filtern Sie die Suspension, die die Fibroblasten enthält, durch ein 85-Mikron-Nylongewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Fibroblastenlösung bei 150 g für 10 Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 bis 200 Mikrolitern vollständigem Wachstumsmedium für die Zellzählung.
Legen Sie die Zellen in einen 25 Quadratzentimeter großen Gewebekulturkolben. Dann wird der Kolben bei 37 Grad Celsius inkubiert. Wechseln Sie das Medium, das nicht anhaftende Zellen enthält, am nächsten Tag und erneut alle drei bis vier Tage.
Wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen, waschen Sie sie mit PBS und fügen Sie Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Nachdem Sie den Kolben drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie drei bis fünf Milliliter warmes vollständiges Nährmedium hinzufügen. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 200 g für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Die Fibroblasten werden in PRP-Medium kultiviert und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die empfohlene Mindestzelldichte beträgt 4.000 lebensfähige Zellen pro Quadratzentimeter.
Ein spezielles medizinisches Gerät wurde verwendet, um PRP herzustellen, indem Vollblut von 10 verschiedenen Patienten verarbeitet wurde. Das Gerät entfernte den Großteil der roten Blutkörperchen und der weißen Blutkörperchen. Die mittlere Thrombozytenkonzentration im PRP war ca. 50 % höher als die Thrombozytenkonzentration im Vollblut.
Autologe Fibroblasten wurden in Medium mit 10%FBS oder in Medien mit PRP-Konzentrationen von eins bis 50% kultiviertNach sieben Tagen Kultur, ohne das Medium zu wechseln, zeigten die mit 20%PRP geprimten Kulturen eine höhere Anzahl lebensfähiger Fibroblasten. PRP hatte eine bis zu 7,7-fache Wirkung als Proliferationsbooster im Vergleich zu FBS. Die Phalloidin-Färbung zeigte, dass die morphologische Veränderung, die bei der PRP-Aktivierung beobachtet wurde, mit der F-Aktin-Reorganisation zusammenhängt, die eine Signatur der Fibroblastenaktivierung ist.
Ein großes Problem bei der schnellen Zellexpansion ist das Risiko genomischer Veränderungen. Um dies zu beurteilen, können Sie einen vergleichenden genomischen Hybridisierungsassay durchführen, um die genomische Stabilität Ihrer Zellen zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, FBS durch ein PRP zu ersetzen, das ein wirksameres autologes biologisches Nahrungsergänzungsmittel ist.
Auf diese Weise können Forscher mehr Zellen schneller wachsen lassen, ohne dass xenogene Substanzen hinzugefügt werden müssen. Wir können diese Technik auch für andere Zelltypen verwenden, die vor der klinischen Anwendung ex vivo expandieren müssen, z. B. Keratinozyten oder mesenchymale Stammzellen.
