Blutplättchen sollten frei von Blutzellen und Proteinen sein, wenn sie ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften untersuchen. Deshalb haben wir ein Protokoll entwickelt, um Blutplättchen aus Mausblut zu reinigen. Diese Technik kann Thrombozyten mit Iohexol Gradienten medium und Low-Speed-Zentrifugation reinigen, was zu einer klaren Trennung der Blutplättchen von anderen Blutbestandteilen.
Um die Blutplättchen zu reinigen, verwenden Sie eine Breitbohrpipettenspitze, um 200 Mikroliter frisch geerntetes Vollblut langsam an der Seite eines 1,5-Milliliter-Rohrs auf 600 Mikroliter Iohexol-Gradientenmedium zu schichten, ohne zu mischen. Nach der Zentrifugation in einem Schwingen-Bucket-Rotor, um die Blutplättchen zu isolieren, verwenden Sie eine neue Breitbohrpipettenspitze, um den größten Teil der plättchenreichen Schicht und einen kleinen Bruchteil der thrombozytenarmen Schicht zu sammeln, ohne die weiße Blutkörperchen- oder Rotblutzellschicht zu aspitrieren. Fügen Sie die Thrombozytenprobe in ein neues Rohr und fügen Sie einen Milliliter PBS zu den Thrombozyten hinzu.
Mischen Sie die Thrombozyten durch Inversion, bevor Sie eine weitere Zentrifugation durchführen. Dann setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter PBS mit leichter Pipettierung wieder auf. Zur Thrombozytenaktivierung ein- bis zweimal 10 auf die sechs Thrombozyten in ein neues Rohr mit 100 Mikroliter Färbepuffer geben.
Fügen Sie ein- bis zweimal 10 zu den sechs Blutplättchen zu einem anderen Rohr mit 100 Mikroliter Färbepuffer, ergänzt mit 0,4-Millimolar GPRP-Peptid. Fügen Sie Thrombin mit dem GPRP-Peptid in die Röhre, um die Blutplättchen zu aktivieren, und fügen Sie den von Interesse sindden Antikörpercocktail in beide Röhren ein. Als Positivkontrolle fügen Sie einen Mikroliter Vollblut in bis zu 100 Mikroliter Färbepuffer in eine Röhre mit 0,4-Millimolar-GPRP-Peptid ein, und fügen Sie Thrombin hinzu, um diese Blutplättchen zu aktivieren.
Als Negativkontrolle, fügen Sie einen Mikroliter Vollblut in bis zu 100 Mikroliter Färbung Puffer. Dann färben Beide Steuerschläuche mit dem Antikörpercocktail. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln die Proben mit einem Milliliter frischer Färbepuffer pro Tube waschen.
Die Pellets in 300 Mikroliter frischer Färbepuffer aussetzen. Übertragen Sie dann die Zellproben in einzelne lichtgeschützte Durchflusszytometrie-Analyseröhren. Um die Thrombozytometrie durch Flusszytometrie zu analysieren, erstellen Sie ein neues Experiment und generieren logarithmische Vorwärtsstreuung im Vergleich zu logarithmischen Seitenstreupunktdiagrammen.
Nachdem Sie die Spannungen bei Bedarf angepasst haben, notieren Sie die einfarbig gefärbten Zellen für die Kompensationssteuerungen. Führen Sie nun die Positivkontrollprobe aus, um genügend Zellen zu erhalten, um die Kompensation und die Tore anzupassen. Erfassen und zeichnen Sie dann 100.000 Ereignisse für jede Vollblutprobe auf, und analysieren Sie die Flusszytometriedaten mithilfe der entsprechenden Plots und Gates.
Wenn das Blut langsam auf das Medium zugesetzt wird, bilden das Iohexol-Gradientenmedium und die Blutprobe zwei separate Schichten in der Röhre. Nach der Zentrifugation enthält die obere, strohfarbene Schicht das Plasma, aber keine intakten Blutkörperchen. Die zweite, weißliche, plättchenreiche Schicht enthält den Großteil der Thrombozyten.
Die dritte, transparente Schicht ist die blutbadige Schicht und befindet sich direkt über der roten Blutkörperchen und dem weißen Blutkörperchen Pellet. Vollblut zeigt unterschiedliche Populationen von roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen auf einer logarithmischen Vorwärtsstreuung versus Seitenstreupunktdiagramm. Gereinigte Blutplättchen weisen jedoch eine ausgeprägte Population mit einer vernachlässigbaren Anzahl roter oder weißer Blutkörperchen auf.
Vollblutproben enthalten Ter119-positive rote Blutkörperchen und CD45-positive weiße Blutkörperchen, die in gereinigten Thrombozytenproben fast fehlen. Unbehandelte gereinigte Thrombozyten drücken fast keine Aktivierungsmarker aus, die ihren Ruhezustand bestätigen, während gereinigte thrombinbehandelte Thrombozyten in der Regel eine 71%P-Selectin-Expression aufweisen. Die mikroskopische Auswertung unbehandelter gereinigter Thrombozytenproben zeigt keine Thrombozytenaggregation.
Nach der Aktivierung mit Thrombin weisen die Thrombozyten jedoch eine robuste Aggregation auf, die ihre Lebensfähigkeit nach der Reinigung, wie nachgewiesen, weiter bestätigt. Schichtdiebe der Blutprobe sorgfältig auf das Iohexol-Medium, und beim Sammeln der Blutplättchen, achten Sie darauf, sorgfältig zu aspirieren, um nicht die roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen Schichten für eine erfolgreiche Thrombozytenreinigung zu sammeln. Diese Methode kann auch für die Thrombozytenreinigung von anderen Arten verwendet werden.
Die gereinigten Blutplättchen können für Genexpression, Aktivierung, Aggregation, Granulatfreisetzung und Adhäsionsstudien verwendet werden.
