Nierentupuloidkulturen können aus gesundem Nierengewebe und aus Urin hergestellt werden, was die Generierung repräsentativer Modelle zur Untersuchung von Nierenerkrankungen und Physiologie ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung gesunder Nierentubuliide aus Gewebe und Urin, wobei letzteres eine nichtinvasive und patientenfreundliche Möglichkeit ist, Material für die Erzeugung von Kulturen zu erhalten. Tubuloidkulturen können verwendet werden, um die Nierenphysiologie zu untersuchen und Krankheiten zu modellieren, wie infektiöse, bösartige und erbliche Nierenerkrankungen.
Um menschliche Nierentuuloide aus Gewebe zu erzeugen, legen Sie die Nierengewebeprobe in einen Milliliter fortgeschrittenes DMEM plus plus plus Medium in eine 10 Zentimeter große Petrischale und verwenden Sie Skalpelle, um das Gewebe in Stücke von etwa einem Kubikmillimeter Größe zu zerkleinern. Verwenden Sie Eine Zette und Skalpelle, um die Gewebestücke in einen 15-Milliliter-Schlauch zu übertragen und das Geschirr mit fünf Millilitern frischem Medium zu waschen. Verwenden Sie eine sterile 10-Milliliter-Pipette, um das Medium in das Röhrchen zu übertragen.
Sedimentieren Sie die Gewebestücke durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in drei bis vier Milliliter Kollagenaselösung. Inkubieren Sie das Gewebe auf einem horizontalen Shaker bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute für 45 bis 60 Minuten mit kräftigem Schütteln alle 15 Minuten. Wenn die Suspension homogen ist und die meisten Gewebestücke verdaut sind, füllen Sie das Röhrchen mit Medium und mischen Sie es fünf- bis 10-mal durch Inversion.
Zentrifuge die Suspension. Wenn das Pellet rot ist, fügen Sie einen Milliliter roten Blutkörperchen-Lysepuffer in das Röhrchen für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Inkubation waschen Sie den Schlauch mit frischem Medium.
Wenn noch Gewebestücke sichtbar sind, resuspendieren Sie das Pellet mit fünf Millilitern frischem Medium und filtern Sie die Suspension durch ein 100 Mikron Zellsieb in ein 50 Milliliter Röhrchen. Übertragen Sie die gefilterte Suspension zur Zentrifugation in ein neues 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie eine P1000-Pipette, die auf ein bekanntes Volumen eingestellt ist, um das Volumen des Zellpellets zu messen. Schalten Sie das Pellet vorsichtig wieder auf, ohne Luftblasen zu erzeugen, und inkubieren Sie die Zellen für eine Minute auf Eis.
Am Ende der Inkubation wird das Pellet in einem 70 bis 75%igen Volumen des Basalmembranextrakts resuspendiert und 15 Mikroliter Tröpfchen der resultierenden Suspension in einer 37 Grad erwärmten Multi-Well-Zellkulturplatte plattiert. Wenn alle Tröpfchen plattiert sind, inkubieren Sie die Platte kopfüber bei 37 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten, fügen Sie dann das entsprechende Volumen von 37 Grad Celsius erwärmtem Kulturmedium hinzu und inspizieren Sie die Kulturen unter einem Hellfeldmikroskop. Um menschliche Nierentuuloide aus Urin zu erzeugen, teilen Sie die Urinprobe gleichmäßig auf 50 Milliliter Röhrchen auf und waschen Sie die Proben zweimal mit 10 bis 20 Millilitern frischem Waschmedium pro Waschgang.
Nach der zweiten Wäsche die Pellets in ihren Restüberständen wieder auffüllen und die Proben in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen für eine dritte Zentrifugation bündeln. Messen Sie das Zellpelletvolumen wie gezeigt und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, ohne Luftblasen zu erzeugen. Nach einer Minute Inkubation in Eis das Pellet in einem 70 bis 75% Volumen basalen Membranextrakt resuspendieren und 15 Mikroliter Tröpfchen der resultierenden Suspension in 37 Grad Celsius erwärmten Multi-Well-Zellkulturplatten wie gezeigt, dann die Tröpfchen kopfüber für 15 bis 20 Minuten inkubieren, bevor frisches Medium hinzugefügt und die Kulturen durch Lichtmikroskopie betrachtet werden.
Verwenden Sie nach ein bis zwei Wochen beider Kulturtypen eine P1000-Pipette, um die Tubuloidtröpfchen in jedem Brunnen zu stören, indem Sie die Spitze verwenden, um die Böden der Vertiefungen zu kratzen, um die angeschlossenen Zellen zu sammeln. Ziehen Sie den Bohrinhalt in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern fortschrittlichem DMEM plus plus plus Medium und sammeln Sie die Tubuloiden durch Zentrifugation. Basierend auf der Größe des Pellets fügen Sie Trypsin-Ersatzmittel hinzu, das mit 10 mikromollaren Y27632 für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius ergänzt wird.
Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Pipettenspitze mit 1.000 Mikrolitern und einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze, die über die Spitze gelegt wird, um die Tubuloidaufhängung 20 bis 30 Mal zu pipetten. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob noch intakte Tubuloide in der Röhre vorhanden sind. Es sind weniger als 10% der intakten Tubuloide vorhanden, füllen Sie das Röhrchen mit frischem fortschrittlichem DMEM plus plus plus und sammeln Sie die Tubuloide durch Zentrifugation, damit das Pelletvolumen wie gezeigt gemessen werden kann.
Resuspend das Pellet in einem 70 bis 75% Volumen des Basalmembranextrakts und Platte 15 Mikroliter Tröpfchen in einer 37 Grad Celsius erwärmten Multi-Well-Zellkulturplatte. Nach einer 15- bis 20-minütigen Upside-Down-Inkubation bei 37 Grad Celsius den Tröpfchen vorgewärmtes Kulturmedium hinzufügen und die Kultur mittels Lichtmikroskopie inspizieren. Tubuloide, die aus Nierengewebeproben erzeugt werden, erscheinen typischerweise innerhalb von sieben Tagen nach der Kulturgründung und müssen innerhalb von ein bis zwei Wochen nach der Beschichtung passageiert werden.
In Urinkulturen treten kompakte tubuloide Strukturen und adhärente Zellen etwa 14 bis 21 Tage nach der Beschichtung auf und die erste Passagierung erfolgt in der Regel zwischen drei und vier Wochen. Das Vorhandensein von zystischen epithelialen Tubuliden nimmt mit jeder Passage zu. Die erfolgreiche Generierung menschlicher Nierentubuloidkulturen kann durch immunhistochemische Färbung auf Marker im tubulären Nierenepithel, wie z. B. pairiertes Box-Gen-8-Protein, beurteilt werden.
Ein korrekter Zeitpunkt der enzymatischen Verdauung von Gewebematerial und eine schnelle Verarbeitung von Urinproben sind entscheidende Schritte für das erfolgreiche Ergebnis dieser Protokolle. Die hohe Effizienz der Etablierung von Nierentupuloidkulturen kann den Weg für patientenspezifische Tests der medikamenteninduzierten Nephrotoxizität ebnen, einer häufigen Nebenwirkung vieler Chemotherapeutika.
