Myofibernekrose ist charakteristisch für mehrere neuromuskuläre Störungen und spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. Eine spezifische, zuverlässige Methode zur Beurteilung der Muskeldegeneration ist wichtig für die Diagnose und translationale Forschung. Diese extrem anpassungsfähige Technik ermöglicht die Gleichzeitige Kennzeichnung von multiplem Antigen im selben Abschnitt innerhalb der Myofiber.
Es ist mit lebenswichtigen Farbstoffen möglich. H&E-Färbung ist eine empirische Methode, die für eine zuverlässige und reproduzierbare Konjugation nicht anpassungsfähig ist. IgG-Aufnahmefärbung ist jedoch spezifisch für nekrotische Muskelzellen und gilt für menschliche Biopsien.
Diese Technik kann Einblick in alle neuromuskulären Störungen geben, die durch Myonekinkismus gekennzeichnet sind. Nach dem Entfernen der Haare aus dem Bein von Interesse stellen Sie das vier Wochen alte männliche mdx Tier in die Supine-Position und sichern Sie die Pfoten an einem Korkbrett. Mit Präzisionsscheren oder Zangen entfernen Sie die Beinhaut vom Fuß bis zum Knie, um die gesamte Länge der Tibia und Tibialis vorderzulegen.
Verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt zwischen der Tibia und dem tibialis vorder zu machen. Verwenden Sie Zangen, um die Epimysiumschicht vorsichtig von der Oberfläche des Muskels zu entfernen. Verwenden Sie am Knöchel die Zange, um die tibialis vordere Sehne von den anderen Sehnen zu isolieren und sanft an der Sehne hochzuziehen, um sie von der Tibia und den umliegenden Muskeln zu isolieren.
Wenn der tibialis vordere Bauch vollständig abgetrennt ist, halten Sie die Sehne so hoch, dass nur der proximale Teil des tibialis vorderen Muskels am Knie befestigt ist. Und die proximale Sehne so nah wie möglich an der Patella abtrennen. Legen Sie den tibialis vorderauf auf ein Stück Gaze leicht mit Salzmittel gedämpft, um ein Trocknen zu vermeiden.
Teilweise tauchen Sie einen Becher mit 70 bis 100 Milliliter Isopentan in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis das Isopentan am Boden des Becherkers zu einem weißen Feststoff wird. Die andere Seite der Korken sorgfältig vorbeschriften, damit die Biopsie nach dem Einfrieren richtig identifiziert werden kann, und etwa 0,5 Milliliter Tragacanth-Kaugummi auf ein 20 mal 11 mal 8 Millimeter großes kreisförmiges Korkstück geben. Verwenden Sie Zangen, um die tibialis vorderin in die Gummi-Distalsehnseite einzubetten.
Halten des Muskels mit seiner Achse senkrecht zur Korkoberfläche. Mindestens die Hälfte der Sehnenseite des Tibialis vorderes sollte vom Zahnfleisch freigelegt bleiben. Dann tauchen Sie den Korken mit dem eingebetteten Muskel schnell in das gekühlte, ungefrorene Isopentan für etwa zwei Minuten, um ein vollständiges Einfrieren zu ermöglichen.
Erhalten Sie Abschnitte des gefrorenen Gewebes, stellen Sie die Kryostattemperatur auf minus 25 Grad Celsius und verwenden Sie die optimale Schnitttemperaturverbindung, um das Gewebe auf den Kryostat-Schneidblock zu fixieren. Trimmen Sie die Probe, bis der Muskelbauch erreicht ist. Erhalten Sie sieben bis zehn MikrometerAbschnitte, die mindestens zwei Abschnitte pro Glasrutsche sammeln und die Dias bei Raumtemperatur platzieren, während die Abschnitte erfasst werden.
Lassen Sie das Gewebe mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur in einer belüfteten Umgebung trocknen. Dann lagern Sie den Abschnitt bei minus 80 Grad Celsius, bis sie färben. Immunolabel der Gewebe.
Zuerst die Dias bei Raumtemperatur mindestens 15 Minuten in der belüfteten Umgebung auftauen. Als nächstes die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift ableiten. Fixieren Sie das Gewebe mit 2%Paraformaldehyd für 10 Minuten in einer feuchten Kammer.
Am Ende einer Fixierung spülen sie die Abschnitte mit zwei 5-minuten-Waschungen in frischem PBS pro Waschgang. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 10%Ziegenserum in PBS verdünnt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur beschriften Sie die Abschnitte mit einem primären Antikörper von Interesse, verdünnt in 5%Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias mit drei 5-minütigen Waschungen in PBS, indem Sie die entsprechenden fluorophor konjugierten Sekundärantikörper 45 Minuten lang bei lichtgeschützter Raumtemperatur etikettieren. Waschen Sie die Dias am Ende der Inkubation mit drei 10-minütigen Wäschen in PBS. Montieren Sie den Abschnitt mit einem fluoreszierenden Montagemedium, das 100 Nanogramm pro Milliliter DAPI und einem Abdeckschlupf enthält.
Dann trocknen Sie die Dias über Nacht bei vier Grad Celsius vor der Bildgebung. Tibialis vordere Muskeln von vier Wochen alten mdx-Mäusen zeigen oft heterogene Profile, einschließlich schlecht betroffener Bereiche in degenerierenden und regenerierenden Bereichen zusammen im selben Querschnitt. Unbeeinflusst von leicht betroffenen Muskelbereichen enthalten Myofiber von großer und homogener Größe und Kerne mit geringer Dichte, die sich hauptsächlich an der Peripherie oder zwischen Myofiberbefinden befinden.
IgG-positive Myofiber fehlen in solchen gesundheitlichen oder leicht betroffenen Bereichen, während IgG-Immunreaktivität innerhalb der Myofiber auf Myonekrose hindeutet. Neu gebildete Myofiber sind in einer kleinen Größe in ihren frühen Stadien der Regeneration nach und nach größer, wie die Muskelvorläufer verschmelzen in beitragzur Synzytialzelle beitragen. Während dieses Prozesses bleiben die Myonukleien im Zentrum des regenerierenden Gewebes mit Clustern von kleinen, zentral nukleierten Myofibern, die auf kürzlich regenerierte Myofiber hinweisen, um das Risiko von Artefakten zu minimieren, ist es wichtig, in den Muskeln gerade zu bleiben, wenn das Gewebe gefriert und bei der richtigen Temperatur.
Isopentan und PFA sollten immer mit Vorsicht und unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden.
