Das allgemeine Ziel des zellbasierten Protokolls ist es, menschliche Melanozytenzellen zu isolieren und zu kulturieren, um die Unzulänglichkeiten konventioneller Methoden zu verbessern. Aus der neuen Methode können wir größere Mengen an primären Melanozytenzellen in relativ kurzer Zeit erhalten, basierend auf Materialien und Ausrüstungen. Menschliches Gewebe, das in diesem Protokoll verwendet wird, sind frische Erwachsene für Hautgewebe, die aus der Beschneidungschirurgie im Krankenhaus entsorgt und gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung 2015120401, Datum 12. Mai 2015, behandelt werden.
Dies ist eine Anzeige aller erforderlichen Reagenzien. Bereiten Sie sterile Instrumente und Materialien im Voraus vor und stellen Sie das Gewebe in eine Schüssel, waschen Sie das Gewebe mit 75% Ethanol für 30 Sekunden und mit Waschen Lösung bindet fünf Minuten jeweils schneidet das Gewebe in bequeme Stücke und schrottet das Gewebe mit chirurgischen Klinge, um die Fettschicht zu entfernen. Abflachen Sie das Gewebe mit der Dermis-Seite nach unten fügen Sie 2,5 Milligramm pro Milliliter die Raumlösung zu den Hautgeweben.
Die Stücke über Nacht bei vier Grad Celsius abdecken und lagern. Am zweiten Tag die Epidermis von der Dermis abziehen und die Epidermis sofort in weitere drei Schüsseln mit Waschlösung übertragen, die wiederum 0,05% Trypsin in die Tube tauchen, die für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Neutralisationslösung hinzu.
Pipetten die Lösung nach oben und unten für 10 bis 15 Mal. Übergeben Sie die Lösung durch einen 100-Mikrometer-Maischefilter. Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten entfernen Sie den Überstand re-suspend die Zellpalette in 10 Milliliter Tiva Medium.
Fügen Sie 10 Mikrometer Y-27632 hinzu. Markieren Sie die Information, dies ist das Sichtfeld unter dem Mikroskop. Es zeigt Zellen, die in der mittleren Inkubation in einem 37 Grad Celsius Inkubator schwimmen.
Diese Ansicht zeigt die Ansicht am zweiten Tag, in der die Zellen begonnen haben, den Boden der Schale zu befestigen. Und der Blick auf Tag neun zeigt offensichtliche Ablagerungen von Melanozyten existieren. Entfernen Sie den Überstand waschen die Zellen mit PBS hinzufügen zwei Millimeter von 0,05%Trypsin inkubieren die Zellen für zwei Minuten fügen Sie zwei Milliliter der Neutralisationslösung.
Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand langsam wieder aufhängen die Zellpalette mit 10 Millimeter Tiva Medium. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
Diese Bilder zeigen die Ansichten von Passage ein schematisches Diagramm, so dass die neue Methode und die herkömmliche Methode in dieser Abbildung dargestellt werden. Das Verfahren zur Gewebeaufbereitung und zur Verdauung neuer Methoden ist das gleiche wie bei der herkömmlichen Methode. Der einzige Unterschied ist, dass die isolierten Fettzellen in 10 Minuten in ihrem Tiva-Medium mit der Anwesenheit von 10 Mikrometer Y-27632 geimpft.
Nach zwei Tagen ersetzen Sie das Medium mit Tiva Medium ohne Ergänzungen bei Y-27632. Dieses Panel zeigt repräsentative Bilder von Melanozyten, die mit der konventionellen Methode in der oberen Reihe hergestellt wurden, und durch die neue Methode untere Reihe am dritten Tag, Tag sechs und Tag acht nach der ersten Impfung nennen wir die Anzahl der Melanozyten am dritten Tag, Tag sechs und acht, wir fanden heraus, dass die neue Methode die Melanozytenausbeute um etwa das Fünffache erhöhte. Nach acht Tagen Konter haben wir Dutzende und zählen die Anzahl der Melanozyten in jedem einzelnen Gericht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der durch eine neue Methode isolierten Melanozyten viel größer ist als die herkömmliche Methode. Ki67 stehend bestätigen, dass Melanozyten, die durch eine neue Methode isoliert werden, sich normalerweise noch wichtiger vermehren können, dass wir mit der neuen Methode eine normale Funktion von Melanozyten erhalten haben. Wir überprüften die Reinheit der Melanozyten nach dem ersten Durchgang aus der Isolation.
Die Passage ein melanocytes für stehen für MITF Ausdruck, die nur in Melanozyten ausgedrückt. Und wir fanden heraus, dass fast 100%zellen positiv für MITF waren, was auf reine Melanozyten hindeutet, die nach dem ersten Durchgang erhalten wurden. Um Melanozyten zu testen, die von den neuen Methoden isoliert sind, kann normal funktionieren.
Wir behandelten Melanozyten mit Kraftkühlung für über 90 in vitro und beobachten, dass Kraftkühlung die Pigmentierung von Melanozyten induzieren kann. Wenn man diese Daten zusammennimmt, deutet dies darauf hin, dass die von der neuen Methode isolierten Melanozyten normalerweise Pigmentierung erzeugen können. Primäre Melanozyten, wie oben angegeben und in der Kultur erweitert wurden leicht für die Laborforschung und die klinischen Anwendungen verwendet.
Nachdem berichtet, dass ID Y-27632 in die ursprüngliche Kultur Medium vor zwei Tagen kann dramatisch erhöhen die aus Melanozyten. Zusammenfassend haben wir erfolgreich eine neue einfache und hocheffiziente Methode etabliert, um reine primäre Melanozyten aus erwachsenen Geweben zu isolieren.
