Zu Beginn nehmen Sie das Gehirn, das von den euthanasierten Mauswelpen isoliert wurde, und legen Sie es in eine drei Zentimeter große Petrischale, die kaltes MEM mit EBSS und 2X PSN enthält. Trennen Sie unter einem Präparierfernrohr die Gehirnhälften, entfernen und verwerfen Sie das Mittelhirn, den Hippocampus und die Hirnhäute. Legen Sie beide kortikalen Hemisphären in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern MEM EBSS mit 2X PSN und halten Sie es auf Eis.
In einer Gewebekulturhaube wird das Medium mit einer Pipette aus dem konischen 50-Milliliter-Röhrchen abgesaugt, wobei die kortikalen Gewebestücke am Boden verbleiben. Fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes Dissoziationsmedium mit einer beschichteten Glaspipette hinzu und reiben Sie das Gewebe 10 bis 20 Mal ein. Die Suspension wird in ein 50-Milliliter-Becherglas gegeben, in dem sich ein kleiner Rührstab befindet, und auf eine Rührplatte gelegt.
Nehmen Sie dann das Becherglas heraus, stellen Sie es drei Minuten lang in einem 30-Grad-Winkel auf, damit sich das Gewebe absetzen kann, und geben Sie die Zellsuspension in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie das konische 50-Milliliter-Röhrchen bei 1000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Ersetzen Sie den Überstand durch gliales Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Die Zellen mit einer Dichte von einer Million in 10 Zentimeter große, mit Zellkulturen behandelte Schalen geben und 24 Stunden lang inkubieren. Ersetzen Sie dann das Medium durch frisches Gliamedium und lassen Sie die Zellen innerhalb von zwei Wochen eine 100%ige Konfluenz erreichen, bevor Sie sie für Experimente plattieren. Platten Sie 100.000 Gliazellen pro Well in Sechs-Well-Platten ab und ermöglichen Sie ihnen, eine Konfluenz von 80 % bis 100 % für eine In-vitro-Prioneninfektion zu erreichen.
Setzen Sie 20% verdünnte Gehirnhomogenate und PBS 30 Minuten lang ultraviolettem Licht aus. Aspirieren Sie das Medium aus der zu infizierenden Gliazelle und fügen Sie 1,5 bis 2 Milliliter gliales Wachstumsmedium mit 0,1 % Normal- oder Prionen-Gehirn-Homogenat pro Vertiefung hinzu. Entfernen Sie nach 72 Stunden das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie frisches Gliawachstumsmedium hinzu.
Das Fettgewebe wird vorsichtig in etwa einem Milliliter HBSS in 0,25%iger Trypsinlösung mit einer serologischen Pipette aspiriert. Übertragen Sie das Gewebe in eine vier Zentimeter große Petrischale, die zwei Milliliter DMEM F-12-Medium mit Dnase-1, Kollagenase und Dispase-Mischung enthält. Schneiden Sie dann das Fettgewebe mit einer Schere in kleine Stücke und inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden.
Übertragen Sie das Gewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, verreiben Sie das Gewebe und pelletieren Sie die stromale Gefäßfraktion, die rot erscheint. Nachdem Sie das Pellet mit sterilem PBS gewaschen und drei Minuten lang zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ADMSC-Medien. Pipettieren Sie anschließend die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um nicht dissoziiertes Gewebe zu entfernen.
Geben Sie neun Milliliter ADMSC-Medium in eine 10 Zentimeter große, mit Zellkulturen behandelte Schale. Pipettieren Sie die abgeseihte Zellsuspension hinein und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und passieren Sie die Zellen, sobald sie eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben.
Nachdem die Zellen zwei bis drei Passagen durchlaufen haben, resuspendieren Sie sie in drei bis 10 Millilitern Medien und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Platte 100.000 Zellen pro Well in Sechs-Well-Platten, die ADMSC-Medien enthalten, und inkubieren Sie über Nacht, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie am nächsten Tag das ADMSC-Medium für Zytokin-stimulierte Zellen entweder mit 10 Nanogramm pro Milliliter TNF-alpha oder 200 Nanogramm pro Milliliter IFN-gamma vor.
Erstellen Sie ADMSC-Medien mit einer Endkonzentration von 0,1 % Prionen-infiziertem oder normalem Gehirnhomogenat für Kontrollproben. Aspirieren Sie das alte Medium, geben Sie 1,5 Milliliter Zytokin oder Gehirnhomogenat-haltiges Medium in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und isolieren Sie die RNA, indem Sie 350 Mikroliter Lysepuffer mit 1 % Beta-Mercaptoethanol in jede Vertiefung geben.
Entfernen Sie Zelllysate mit einem Zelllifter und transkribieren Sie 25 Nanogramm RNA pro Probe rückwärts und amplifizieren Sie komplementäre DNA. Platte BV2-Mikroglia mit 50.000 Zellen pro Well oder primäre gemischte Gliazellen mit 100.000 Zellen pro Well in einer Sechs-Well-Platte. Behandeln Sie BV2-Zellen mit Medien, die 0,1 % Prionen-infiziertes oder normales Gehirn enthalten, homogenisieren Sie sie und inkubieren Sie sie 72 Stunden lang.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit PBS, um das restliche Gehirnhomogenat zu entfernen. Geben Sie frisches Medium in die Zellen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Um ADMCs zu stimulieren, behandeln Sie sie 24 Stunden lang mit 10 Nanogramm pro Milliliter TNF-alpha, bevor Sie sie mit BV2 oder gemischten Gliazellen co-kultivieren.
Waschen Sie die stimulierten ADMCs dreimal mit PBS und schleudern Sie die ADMSC-Suspension wie zuvor gezeigt. Ersetzen Sie das Medium auf BV2-Zellen oder gemischten Gliazellen durch zwei Milliliter ADMSC-Medium pro Vertiefung und setzen Sie Einsätze für Sechs-Well-Platten mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern in die Hälfte der Vertiefungen ein. Fügen Sie jedem Einsatz zwei Milliliter ADMSC-Medien hinzu, und fügen Sie weitere zwei Milliliter Medien zu Vertiefungen hinzu, die keine Einfügungen erhalten.
Nach dem Pelletieren resuspendieren und zählen Sie die ADMCs, fügen Sie jedem Einsatz 50.000 bis 100.000 Zellen hinzu und inkubieren Sie sie. Entfernen und entsorgen Sie am Ende der Inkubation die Einsätze oder setzen Sie sie in eine neue Sechs-Well-Platte ein und waschen Sie die Einsätze zweimal mit PBS. Geben Sie den vom RNA-Isolationskit bereitgestellten Puffer zu den gemischten Glia- oder BV2-Zellen und kratzen Sie die Vertiefungen ab.
