Beginnen Sie mit dem Umfüllen der zuvor aufgetauten Suspension der Bauchspeicheldrüsentumorzellen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie PBS hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erreichen. Verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die Quantität und Qualität der Zellen zu bewerten. Sobald das Zellpellet durch Zentrifugation gewonnen wurde, wird der Überstand mit immer kleineren Pipettenspitzen vorsichtig dekantiert, um die Pelletverteilung zu minimieren und gleichzeitig die dekantierte Flüssigkeit zu maximieren.
Bereiten Sie 1X Zelllysepuffer vor und fügen Sie dann 100 Mikroliter davon zu 900 Mikrolitern zuvor hergestelltem Zelllyse-Verdünnungspuffer hinzu, um 0,1X Zelllysepuffer zu erhalten. 100 Mikroliter gekühlter 0,1-facher Zelllysepuffer in das Zellpellet geben und fünfmal vorsichtig pipettieren, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten. Nach einer dreiminütigen Inkubation auf Eis geben Sie einen Milliliter gekühlten Waschpuffer in das resuspendierte Pellet und pipettieren es fünfmal vorsichtig.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand wie vorgeführt verworfen und dieser Waschvorgang noch zwei weitere Male wiederholt. Laden Sie eine mit Trypanblau gefärbte Suspension in ein Hämozytometer, um die Anzahl der Kerne zu zählen. Resuspendieren Sie das Kernpellet in 1X-Kernpuffer basierend auf der zielgerichteten Kernrückgewinnung.
Führen Sie die resuspendierten Zellkerne vorsichtig durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb mit Pipettenspitze und halten Sie es dann auf Eis. Zählen Sie nun die Kerne nach. Die mit dieser Methode gewonnenen Kerne wiesen eine angemessene Größe und Form auf.
Gelegentlich kann eine leichte Tupfung der Kernhülle beobachtet werden, die bei der abschließenden Kernuntersuchung mittels Hämozytometer überwacht werden sollte.
