Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS ve Helmut Weigelin, MLS (ASCP) laboratuvarımızda bu ekstraksiyon yönteminin kurulmasında etkili oldular.

Mevcut protokol, insan bakımı yönergelerini ve Michigan Üniversitesi kurumsal inceleme kurulunun (IRB) onayını takip eder. Bunun için IRB'den bilgilendirilmiş onam feragatnamesi alındı. İlgili hastalar için ilgili dahil etme veya dışlama kriterleri yoktur.
1. Hücresel ve hücresiz bileşenlerin ayrılması
NOT: VRL tanı testi için üç tip numune alınabilir: vitreus (seyreltilmemiş; infüzyona başlamadan önce toplanan vitrektomi sıvısı), bir kaset torbası içinde seyreltilmiş vitreus (Şekil 1) ve sulu hümör (gözün ön odasından sıvı).
<ol><li>Çok viskoz olan seyreltilmemiş vitreus sıvısı için, pipetlemeyi kolaylaştırmak için 3-5 mL PBS ile seyreltin.</li>
	<li>Kaset torbası içindeki seyreltik vitreus için (Ek Şekil 1), sıvıyı 50 mL konik tüplere boşaltın (her 45 mL sıvı için bir tane).</li>
	<li>Sulu mizah hacmi çok düşüktür (<200 μL). Hücrelerin maksimum geri kazanımını sağlamak için, numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın, numunenin toplandığı orijinal 500 μL mikrosantrifüj tüpünü eşit hacimde PBS ile durulayın ve 1.5 mL'lik tüpe ekleyin.</li>
	<li>Camsı veya sulu sıvıyı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.</li>
</ol>2. Hücresel bileşenden DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (küçük pelet için 300 μL, daha büyük pelet için 1 mL veya daha fazla) (bkz. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.</li>
	<li>Tamamen parçalandığında, protein çökelti çözeltisinin toplam hacminin 1/3'ünü ekleyin (300 μL lizat için 100 μL) (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>20-30 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 3 dakika döndürün.</li>
	<li>300 μL izopropanolü temiz bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Süpernatanı önceki adımdan izopropanol tüpüne dikkatlice pipetleyin.</li>
	<li>1.5 μL 20 mg / mL glikojen ekleyin (300 μL lizis için) (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Ters çevirerek iyice karıştırın, ardından DNA çökelmesine yardımcı olmak için numuneyi 1 saat ila gece boyunca -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.</li>
	<li>1.5 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. İzopropanolü pipetleyin.</li>
	<li>0,5 mL %70 etanol ekleyin ve peleti yıkamak için tüpü ters çevirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 1 dakika döndürün ve etanolü boşaltın. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Çözeltiyi boşaltmak ve peleti veya dekantı kurutmak için tüpü temiz gazlı bez üzerinde ters çevirin. DNA'yı bir mikrosantrifüjde hızlı bir şekilde döndürün ve kalan etanol damlasını ince uçlu tek kullanımlık bir pipet ucuyla pipetleyin (tüpte artık etanol kalmadığında, DNA 5-10 dakika içinde kuru ve hidratlanmaya hazır olmalıdır).</li>
	<li>Kurutulmuş DNA peletine 45 μL DNA hidrasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 50 °C'de bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 1-2 saat çözünmesine izin verin. Hidrasyon sürecini hızlandırmak için DNA'yı yukarı ve aşağı pipetleyin. NOT: Örnek çok viskoz görünüyorsa daha fazla DNA hidrasyon solüsyonu ekleyin.</li>
</ol>3. Hücresiz DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Adım 1.5'teki süpernatan miktarı değişkendir. Süpernatantın her mililitresi için 70 μL şartlandırma tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>Temizleme boncuklarını girdap yaparak iyice karıştırın. <14 mL hücresiz süpernatan işleniyorsa 10 μL, 14-40 mL işleniyorsa 20 μL temizleme boncukları ekleyin.</li>
	<li>Numune/boncuk karışımını girdaplayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Peleti bozmadan, 10 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 100 μL ve 20 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 200 μL geride bırakarak süpernatanı pipetleyin.</li>
	<li>Peletlere eşit hacimde İdrar Pelet Sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin ve peleti girdap veya pipetleme yoluyla iyice yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş pelete Proteinaz K (%5 (h/h)) ekleyin (örneğin, 200 μL karışıma 10 μL Proteinaz K ekleyin) ve hafifçe girdaplama ile iyice karıştırın.</li>
	<li>Pelet karışımını 55 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Sindirim karışımına bir hacim Genomik lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (örneğin, 210 μL Genomik lizis tamponu ila 210 μL sindirim karışımı) ve vorteksleme ile karıştırın.</li>
	<li>Piyasada bulunan sıkma kolonunu (Malzeme Tablosuna bakın) yeni bir toplama tüpüne aktarın.</li>
	<li>Döndürme kolonuna 200 μL İdrar DNA Hazırlama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.</li>
	<li>Kolona 700 μL İdrar DNA yıkama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.</li>
	<li>Adımı 200 μL İdrar DNA yıkama tamponu ile tekrarlayın.</li>
	<li>Spin kolonunu DNase / RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Uygun hacimde DNA elüsyon tamponunu (yapılacak moleküler testlere göre) doğrudan kolon matrisine ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika bekletin. NOT: Örnek durumlarda 30 μL elüsyon tamponu kullanılmıştır. Ek test gerekiyorsa daha fazla elüsyon tamponu kullanılır.</li>
	<li>Hücresiz DNA'yı elde etmek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
</ol>

Hücresiz DNA Kullanılarak Vitreoretinal Lenfoma Tanısı

<ol>
	<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+vitreoretinal+lymphoma:+a+report+from+an+International+Primary+Central+Nervous+System+Lymphoma+Collaborative+Group+symposium.">Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium.</a> Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).</li><li>Sagoo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+intraocular+lymphomas.">Primary intraocular lymphomas.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).</li><li>Coupland, S. E., Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+intraocular+lymphomas.">Understanding intraocular lymphomas.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).</li><li>Cassoux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+and+central+nervous+system+lymphoma:+clinical+features+and+diagnosis.">Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).</li><li>Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+masquerade+syndrome.">Neoplastic masquerade syndrome.</a> Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).</li><li>Carbonell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+recommendations+for+the+diagnosis+of+vitreoretinal+lymphoma.">Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).</li><li>Demirci, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+humor-derived+MYD88+L265P+mutation+analysis+in+vitreoretinal+lymphoma:+a+potential+less+invasive+method+for+diagnosis+and+treatment+response+assessment.">Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment.</a> Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).</li><li>Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrectomy:+a+pars+plana+approach.">Vitrectomy: a pars plana approach.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).</li><li>Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulum+cell+sarcoma+of+the+retina+and+uvea.+Report+of+sex+cases+and+review+of+the+literature.">Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature.</a> American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).</li><li>Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+intraocular+lymphoma+study+group.+clinical+features+and+diagnostic+significance+of+the+intraocular+fluid+of+217+patients+with+intraocular+lymphoma.">Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).</li><li>Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+testing+of+vitrectomy+specimens.">Diagnostic testing of vitrectomy specimens.</a> American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).</li><li>Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+intraocular+lymphoma+(ocular+reticulum+cell+sarcoma)+diagnosis+and+management.">Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management.</a> Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).</li><li>Tanaka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+accurate+diagnosis+of+vitreoretinal+lymphoma+using+a+combination+of+diagnostic+test+results:+a+prospective+observational+study.">More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).</li><li>Missotten, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+immunophenotyping+is+a+valuable+tool+for+detection+of+intraocular+lymphoma.">Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma.</a> Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).</li><li>Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+large+B-cell+lymphomas.+Flow+cytometric+pitfalls+and+pathologic+correlation.">Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation.</a> American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).</li><li>Bonzheim, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+hallmarks+of+primary+and+secondary+vitreoretinal+lymphoma.">The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma.</a> Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+the+high+prevalence+of+MYD88+L265P+mutated+vitreoretinal+lymphoma+identified+by+droplet+digital+polymerase+chain+reaction.">Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction.</a> Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).</li><li>Bustamante, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+tracking+through+driver+mutations+as+a+liquid+biopsy-based+marker+for+uveal+melanoma.">Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Vitreoretinal lenfoma (VRL), semptomları diğer vitreoretinal hastalıkları taklit edebilen agresif büyük bir B hücreli lenfomadır1,2,3 4,5. Vitreusun ve daha yakın zamanda aköz mizahın moleküler testi, VRL tanısı koymak veya ekarte etmek için kritik bir yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, bu sıvılar hacim olarak çok düşüktür ve genellikle d...

Vitreoretinal lenfoma (VRL), primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma 1,2,3 ile ilişkili agresif bir lenfomadır. VRL, merkezi sinir sisteminekatılımı nedeniyle tipik olarak ölümcüldür 1,2. Nadir görülmeklebirlikte 1,4, VRL sıklıkla posterior üveit ve diğer vitreoretinal hastalıklara benzer semptomlarla kendini gösterir 4,5. Sonuç olarak, üveit semptomları sergileyen hastalar, VRL'yi doğrulamak veya ekarte etmek için bir tanıya ihtiyaç duyarlar.
Son zamanlarda, klinik muayene ve laboratuvar bulgularının bir kombinasyonunu içeren VRL tanısı için konsensüs kriterleri yayınlanmıştır6. VRL'yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan örnekler arasında vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah7 bulunur. Vitreus mizahı, pars plana vitrektomi adı verilen ve gözün arka segmentine erişim sağlayan cerrahi bir prosedürle elde edilir8.
Sunulan protokolde, hücresel ve cfDNA ekstraksiyonu için hem sulu mizah hem de vitreus mizah örnekleri toplandı. Hastalar uyuşturulduktan ve kornea limbusundan yaklaşık 4 mm uzağa trokarlar yerleştirildikten sonra, kornea limpusuna 1 mL tüberkülin şırıngası kullanılarak yaklaşık 100-200 μL'lik sulu mizah örneği elde edildi. Psödofakik hastalar için, infüzyona steril hava verilerek seyreltilmemiş vitreus elde edildi ve daha fazla miktarda seyreltilmemiş vitreus (3.5 mL'ye kadar) toplandı. Fakik hastalarda, dengeli tuz çözeltisi infüzyonu açılmadan önce yaklaşık 500 ila 1000 μL seyreltilmemiş vitreus çıkarıldı. Bazı durumlarda, infüzyonu sıvıya çevirerek ve bu numuneyi elde etmek için vitrektörü vitreus eteğine yerleştirerek ikincil olarak seyreltilmiş vitreus (500 ila 2.000 μL) toplandı. En seyrek vitreus fraksiyonu ameliyat sonunda kaset torbası korunarak toplandı (Ek Şekil 1). Bu torba patoloji bölümüne ulaştığında, daha sonra DNA ekstraksiyonu için bu torbadan sıvının konik tüplere boşaltılmasından seyreltik vitreus elde edildi.
Vitreus sıvısının sitopatolojisi genellikle altın standart olarak kabul edilir9. Bununla birlikte, birkaç çalışma, işleme ve minimum hücresellik nedeniyle sınırlı hassasiyet göstermiştir10,11,12. Akış sitometrisi, klonal B hücrelerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir, ancak aynı zamanda düşük hücresellik ve büyük lenfoma hücrelerinin kırılganlığı ile de sınırlandırılabilir13,14,15. Hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, sağlam tüm hücreler gerektirir. Bu hücrelerin çoğu toplama, depolama ve işleme sırasında yok edilir. Moleküler test, bozulmamış hücrelerden (hücresel DNA) ekstrakte edilen DNA kullanılarak yapıldığında, aynı sınırlamadan muzdariptir. Ek olarak, tüm bu testler için sınırlı vitreus örneğinin bölünmesi, her test için mevcut malzeme miktarını azaltır.
Hücresiz DNA (cfDNA), bozulmamış hücrelere ihtiyaç duymayan başka bir DNA kaynağını temsil eder. Vitreus örneklerinden alınan cfDNA, VRL 16,17 ve uveal melanom 18'in tespiti için kullanılmıştır. Bu protokolde, VRL'yi tespit etmek için vitröz ve sulu sıvıdan hücresel ve hücresiz DNA ekstrakte edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A415-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-10</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentra Puregene Cell Lysis Solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentra Puregene DNA Hydration Solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentra Puregene Protein Precipitation Solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-DNA Urine Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D3061</td>
			<td>Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Glycogen, 20 &#181;g/&#181;L (20 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher/Invitrogen</td>
			<td>10814010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free dna extraction of vitreous and aqueous humor specimens for diagnosis and monitoring of vitreoretinal lymphoma

Vitreoretinal lenfoma (VRL), sıklıkla primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma olarak sınıflandırılan agresif bir lenfomayı temsil eder. VRL'yi teşhis etmek için vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah gibi örnekler toplanır. Bu örneklerde VRL için tanı testleri sitoloji, akış sitometrisi ve moleküler testleri içerir. Bununla birlikte, hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, hücresel DNA kullanılarak yapılan moleküler testlerle birlikte, sağlam bütün hücreler gerektirir. Buradaki zorluk, camsı ve sulu mizahın tipik olarak düşük hücreselliğe sahip olması ve toplama, depolama ve işleme sırasında birçok hücrenin tahrip olması gerçeğinde yatmaktadır. Ayrıca, bu numuneler, vitreus mizahının yüksek viskozitesi ve hem vitreus hem de sulu mizahın düşük hacmi nedeniyle moleküler testler için ek zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, camsı ve sulu örneklerden hücresiz DNA'nın ekstraksiyonu için bir yöntem önermektedir. Bu yaklaşım, hücresel DNA'nın ekstraksiyonunu tamamlar veya bu örneklerin hücresel bileşeninin sitoloji ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer tanı yöntemleri için kullanılmasına izin verir.

Vitreoretinal lymphoma (VRL) is an aggressive lymphoma associated with primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma1,2,3. VRL is typically fatal due to its involvement in the central nervous system1,2. Although rare1,4, VRL often presents with symptoms similar to posterior uveitis and other vitreoretinal diseases4,5. Consequently, patients exhibiting uveitis symptoms require a diagnosis to either confirm or rule out VRL.
Recently, consensus criteria for diagnosing VRL were published, which involve a combination of clinical examination and laboratory findings6. Specimens commonly used to diagnose VRL include vitreous humor and, more recently, aqueous humor7. Vitreous humor is obtained through a surgical procedure called pars plana vitrectomy, which allows access to the posterior segment of the eye8.
In the presented protocol, both aqueous humor and vitreous humor specimens were collected for cellular and cfDNA extraction. After anesthetizing the patients and placing trocars approximately 4 mm from the corneal limbus, an aqueous humor sample of approximately 100-200 &#181;L was obtained using a 1 mL tuberculin syringe at the corneal limbus. For pseudophakic patients, undiluted vitreous was obtained by introducing sterile air into the infusion, enabling the collection of a larger amount of undiluted vitreous (up to 3.5 mL). In phakic patients, approximately 500 to 1000 &#181;L of undiluted vitreous was removed before turning on an infusion of balanced salt solution. In some cases, secondarily diluted vitreous (500 to 2,000 &#181;L) was collected by switching the infusion to fluid and placing the vitrector within the vitreous skirt to obtain this sample. The most dilute vitreous fraction was collected by preserving the cassette bag (Supplemental Figure 1) at the end of the surgery. Once this bag reached the pathology department, dilute vitreous was obtained from draining fluid out of this bag into conical tubes for subsequent DNA extraction.
Cytopathology of vitreous fluid is often considered the gold standard9. However, several studies have demonstrated limited sensitivity due to processing and minimal cellularity10,11,12. Flow cytometry can aid in identifying clonal B-cells but can also be limited by low cellularity and the fragility of large lymphoma cells13,14,15. Both cytopathology and flow cytometry requires intact whole cells. Many of these cells are destroyed during collection, storage, and processing. When molecular testing is performed using DNA extracted from intact cells (cellular DNA), it suffers from this same limitation. In addition, dividing the limited vitreous specimen for all of these tests reduces the amount of material available for each test.
Cell-free DNA (cfDNA) represents another source of DNA that does not require intact cells. cfDNA from vitreous specimens has been used for the detection of VRL16,17 as well as uveal melanoma18. In this protocol, cellular and cell-free DNA are extracted from vitreous and aqueous fluid to detect VRL.

Yazar Spotlight: Vitreus Mizahından Hücresiz DNA Ekstraksiyonu Kullanarak VRL Teşhisini İlerletme 

Vitreoretinal Lenfoma Tanı ve İzlemi için Vitreus ve Sulu Mizah Örneklerinin Hücresiz DNA Ekstraksiyonu

With this research, we are attempting to use molecular testing of vitreous humor collected from the eye by vitrectomy to diagnose vitreoretinal lymphoma or VRL, which is an aggressive disease whose symptoms overlap those of common inflammatory ocular conditions. Cytopathology flow cytometry and molecular testing are current methods used to diagnose VRL. Published sensitivities of non molecular methods are 44 to 90%for cytopathology and 50 to 60%for flow cytometry, cytopathology, flow cytometry and molecular testing with cellular DNA requires intact neoplastic cells.That poses a problem in vitreous humor specimens because the volume and cellularity of these specimens is low and cells can be degraded by apoptosis as well as specimen collection, processing and storage. We found that cell-free DNA extracted from vitreous fluid specimens provides another source of DNA from molecular testing that does not require intact cells, and that also shows evidence of VRL and can be used to diagnose this lymphoma. Cell-free DNA extraction offers molecular testing without intact neoplastic cells.This allows maximizing the utility of vitreous specimens as intact cells can be reserved for cytopathology and flow cytometry while utilizing the remaining supernatant fluid that would otherwise be discarded for molecular testing.

Bu ekstraksiyon yöntemleri, vitröz (dört) ve sulu (dört) örneklerden elde edilen hücresel DNA ile karşılaştırıldığında hücresiz DNA'nın yeterli verimini ve amplifiye edilebilirliğini sağlamak için sınırlı sayıda vaka üzerinde gerçekleştirildi. Bu örneklerden, bu sıvıların hücresiz bileşeninden elde edilen DNA verimleri, hücresel bileşeninkine benzer (Tablo 1). Bu örneklerden elde edilen hücresel ve cfDNA, VRL ile ilişkili mutasyon MYD88 L265P gibi moleküler ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor at JoVE.com

Vitreoretinal lenfoma teşhisi için moleküler çalışmalar yapmak üzere vitreus ve sulu mizahtan hücresiz DNA ekstrakte etmek için bir prosedür burada oluşturulmuştur. Yöntem, numunenin hücresel bileşeninden DNA'yı eşzamanlı olarak çıkarma veya yardımcı test için ayırma yeteneği sunar.

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...

Bu araştırma ile, vitreoretinal lenfoma veya semptomları yaygın inflamatuar oküler durumlarla örtüşen agresif bir hastalık olan VRL'yi teşhis etmek için vitrektomi ile gözden toplanan vitreus mizahının moleküler testini kullanmaya çalışıyoruz. Sitopatoloji, akım sitometrisi ve moleküler testler VRL tanısında kullanılan güncel yöntemlerdir. Moleküler olmayan yöntemlerin yayınlanmış duyarlılıkları sitopatoloji için %44-90 ve akım sitometrisi, sitopatoloji, akım sitometrisi için %50-60'tır ve hücresel DNA ile yapılan moleküler testler bozulmamış neoplastik hücreler gerektirir.Bu, vitreus mizah örneklerinde bir sorun teşkil eder, çünkü bu örneklerin hacmi ve hücreselliği düşüktür ve hücreler, örnek toplama, işleme ve depolamanın yanı sıra apoptoz ile parçalanabilir. Vitreus sıvısı örneklerinden ekstrakte edilen hücresiz DNA'nın, bozulmamış hücreler gerektirmeyen moleküler testlerden başka bir DNA kaynağı sağladığını ve ayrıca VRL kanıtı gösterdiğini ve bu lenfomayı teşhis etmek için kullanılabileceğini bulduk. Hücresiz DNA ekstraksiyonu, bozulmamış neoplastik hücreler olmadan moleküler test sunar.Bu, vitreus örneklerinin faydasını en üst düzeye çıkarmaya izin verir, çünkü sağlam hücreler sitopatoloji ve akış sitometrisi için ayrılabilirken, aksi takdirde moleküler test için atılacak olan kalan süpernatan sıvıyı kullanır.

cell-free-dna-extraction-vitreous-aqueous-humor-specimens-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

1.1K Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Bu araştırma ile, vitreoretinal lenfoma veya semptomları yaygın inflamatuar oküler durumlarla örtüşen agresif bir hastalık olan VRL'yi teşhis etmek için vitrektomi ile gözden toplanan vitreus mizahının moleküler testini kullanmaya çalışıyoruz. Sitopatoloji, akım sitometrisi ve moleküler testler VRL tanısında kullanılan güncel yöntemlerdir. Moleküler olmayan yöntemlerin yayınlanmış duyarlılıkları sitopatoloji için %44-90 ve akım sitometrisi, sitopatoloji, ak...