Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie Immobilisierungsdivots in Agarose erzeugen. Erhitzen und mischen Sie dazu 2%ige Agarose in PBS in einer Mikrowelle, bis sich die Lösung verflüssigt hat. Pipettieren Sie 250 Mikroliter der verflüssigten Agarose in eine Schale mit Glasboden.
Und mit einem flexiblen Plastikdeckglas die Agarose auf der Schale flach drücken. Sobald die Agarose abgekühlt und vollständig erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Führen Sie dann mit einer drei Millimeter langen Biopsiestanze ein Loch in die Agarose in der Mitte der Schale.
Entfernen Sie überschüssige Agarose mit Hilfe eines feinen Arbeitstuchs. Lagern Sie die mit PBS hydratisierte Agaroseform bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Vor der Montage der isolierten verspiegelnden Okularlinse werden je nach Linsentyp zwei Milliliter des entsprechenden Mediums in die vorbereitete Agaroseform gegeben.
Übertragen Sie die fixierte oder lebende Linse vorsichtig mit einer Embryozange in das Divot in der Agarose. Stellen Sie dann die Schale auf einen inversen Mikroskoptisch. Vergewissern Sie sich, dass die Linse so positioniert ist, dass der vordere Bereich dem Objektiv zugewandt ist, indem Sie die Färbung der Zellkerne visualisieren.
Wenn keine Kerne beobachtet werden, drehen Sie die Linse mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig um etwa 180 Grad, so dass der vordere Bereich zum Objektiv zeigt. Als Nächstes nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf. Für die Visualisierung von Linsenkapseln nehmen Sie Z-Stapel-Bilder mit einem 40-fachen Objektiv mit einer Schrittweite von 0,3 Mikrometern auf.
Das erste Bild vor der Oberfläche der Linsenkapsel, angezeigt durch WGA-Färbung, und das letzte Bild nach der apikalen Oberfläche der Epithelzellen. Um Epithelzellen zu visualisieren, nehmen Sie Z-Stapelbilder mit einem 63-fachen Objektiv mit einer Schrittweite von 0,3 Mikrometern auf.
