Zelluläre Fraktionierung von Rhesusaffen-Pankreasinseln für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Metabolomik

Tauen Sie zunächst das isolierte Rhesusaffen-Pankreas-Inselgewebe auf Eis auf. Geben Sie 500 Mikroliter 0,1-fachen Lysepuffer in das Gewebepellet. Mit einem RNase-freien Einweg-Pelletstößel das Gewebe 15 Mal vorsichtig auf Eis homogenisieren.

Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann 500 Mikroliter Waschpuffer zum Homogenat und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette auf Eis. Entleeren Sie einen 30-Mikrometer-Vorabscheidefilter mit 300 Millilitern Waschpuffer und filtrieren Sie einen Milliliter zelluläres Homogenat in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie das gefilterte Homogenat bei 500 g fünf Minuten lang in einer schwingenden Eimerzentrifuge bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie mit einer Pipette einen Milliliter des Überstands in ein Kryogefäß auf Eis und frieren Sie es sofort bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Metabolomik-Experimente ein. Geben Sie einen Milliliter Waschpuffer tropfenweise zum Kernpellet, um es wieder zu resuspendieren.

Schleudern Sie das gewaschene Pellet bei 1.000 g fünf Minuten lang in einer schwingenden Eimerzentrifuge bei vier Grad Celsius. Nach Wiederholung der Wäsche resuspendieren Sie die Kerne in einem Milliliter Waschpuffer. Mischen Sie mit einer Pipette jeweils 10 Mikroliter Zellkernsuspension und 0,4 % Trypanblau in einem separaten Röhrchen und geben Sie die Mischung in einen automatischen Zellzähler.

Bestimmen Sie abschließend mit einem Zellzähler die Kernkonzentration. Für die Sequenzierungsexperimente wurde ein idealer intakter Zellkern gewonnen. Basierend auf Genexpressionsstudien wurde das UMAP-Clustering von zellulären Subtypen innerhalb isolierter fötaler, nicht-menschlicher Primateninseln erhalten.

Die Häufigkeit von Inselmetaboliten wie Dihydroxyacetonphosphat, Glycerin-3-phosphat, 2-Oxoglutarat, Kreatin und Glutathion wurde unter Verwendung der zytosolischen Fraktionen erhalten.