Holen Sie sich zunächst eine PANC-1-Zellkultur und waschen Sie die Zellen mit neun Millilitern der ausgewogenen Salzlösung von Hank in drei Milliliter-Schritten. Inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern Trypsin für etwa 10 Minuten. Um die Suspension zu neutralisieren, fügen Sie drei Milliliter DMEM hinzu, die mit 10% FBS ergänzt sind.
Nachdem Sie die Zellen siebenmal mit einem Milliliter-Medium gewaschen haben, sammeln Sie jedes neutralisierte Aliquot in einem 15-Milliliter-Röhrchen. In ähnlicher Weise erhalten Sie trypsinisierte humane Pankreas-Sternzellen oder HPaSteC unter Verwendung von Trypsin-Neutralisationslösung und Sternzellmedien. Mischen Sie die erforderliche Menge beider Zellsuspensionen in 11 Millilitern DMEM mit 10 % FBS, um Schaumbildung zu vermeiden.
100 Mikroliter Zellsuspensionsmischung vorsichtig in die Kulturplatte geben und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Geben Sie am dritten Tag 50 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung an der Seite der Vertiefung. An Tag 10 oder 11 aspirieren Sie das verbrauchte Medium, ohne die Lösung in der Nähe des Halos zu stören, und fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium entlang der Seite jeder Vertiefung hinzu.
Entfernen Sie am 14. oder 17. Tag mit einer Ein-Milliliter-Pipette das Medium aus jeder Vertiefung, bis der Halo erreicht ist. Richten Sie die Platte gegen den Hintergrund der Haube aus, um die Sphäroide an der Unterseite zu platzieren. Pipettieren Sie vorsichtig etwa 50 Mikroliter des Mediums in der Nähe der Sphäroide, um es für das Pooling zu stören.
Es zeigte sich, dass die am Tag 14 gewonnenen Sphäroide ein durchschnittliches Volumen von 0,048 Kubikmillimetern erreichten.
