Extrahieren Sie zunächst DNA aus Fliegenproben mit einem DNA-Extraktionskit. Verwenden Sie dann ein Mikroplatten-Reader, um die Werte von OD260 und OD280 zu bestimmen und so die DNA-Reinheit und die Nukleinsäurekonzentration zu vergleichen. Bereiten Sie als Nächstes Fluorometer-Standardlösungen vor, indem Sie 190 Mikroliter Arbeitslösung in zwei 0,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben.
Geben Sie dann je 10 Mikroliter Standard eins und Standard zwei zu den Arbeitslösungen. Halten Sie die Röhren mindestens 15 Minuten lang von Licht fern. Mischen Sie zwei Mikroliter Test-DNA mit 198 Mikrolitern Arbeitslösung in einem 0,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Mischung mindestens 15 Minuten lang im Dunkeln.
Schalten Sie das Fluorometer nach 15 Minuten ein und wählen Sie die dsDNA-Konzentrationsmessung, Einstellung für große Reichweite. Testen Sie die erste und zweite Norm, um die Standardkurve zu erhalten. Legen Sie dann die zu testenden Proben in die Assay-Wells.
Stellen Sie das DNA-Spike-Volumen auf zwei Mikroliter ein und führen Sie die Messung durch. Um die DNA sichtbar zu machen, werden zunächst 20 Mikroliter der PCR-Amplifikationsreaktion eingerichtet. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie die PCR-Zyklen durch.
Nach der PCR werden die Produkte einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Geben Sie dann das Gel zur Fotoanalyse auf ein Gel-Bildgebungssystem. Die Bewertung der extrahierten DNA-Reinheit mit dem Mikroplatten-Reader zeigte, dass alle frischen Proben und die alte Probe ein OD260-zu-OD280-Verhältnis von über zwei aufwiesen.
Im Gegensatz dazu zeigte die alte Stichprobe zwei ein niedrigeres Verhältnis. Die DNA-Konzentration, die aus OD260-Messwerten abgeleitet wurde, war in frischen Proben am höchsten, gefolgt von der alten Probe eins und am niedrigsten in der alten Probe zwei. Die elektrophoretische Analyse ergab Banden im Bereich von 250 bis 400 Basenpaaren, die in frischen Proben im Vergleich zu alten stärker ausgeprägt waren.
