Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (82060341, 81560304) und von der Academician Innovation Platform Scientific Research Project der Provinz Hainan (YSPTZX202134) unterstützt.

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden insgesamt fünf Proben von C. megacephala verwendet - drei frische Proben (Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3), eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde (Old 1) und eine Probe, die 2 Jahre lang in einer trockenen, versiegelten Lagerung gelagert wurde, die nur vor Licht geschützt war (Old 2). Die Proben müssen entsprechend den experimentellen Anforderungen gekennzeichnet werden.
1. Allgemeine Probenlagerung und -vorbereitung
<ol><li>Probenauswahl und -vorbereitung HINWEIS: Achten Sie darauf, im Abzug zu arbeiten, wenn Sie Ethylacetat auftragen, um nekrophage Fliegen zu exekutieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit von der Oberfläche der Fliege, bevor Sie sie wiegen.<ol><li>Frische Proben: Legen Sie drei gesammelte Fliegenproben in Gasfläschchen, nachdem Sie sie mit Ethylacetat getötet haben. Wiegen und benennen Sie die Proben als Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3 und verwenden Sie sie sofort in Experimenten. HINWEIS: Die frischen Fliegenproben in diesem Protokoll wiesen Massen von 56,8 mg, 49,3 mg und 52,1 mg auf.</li>
		<li>Alte Probe 1: Fliegenproben, die durch Ethylacetat abgetötet und in mit Alkohol gefüllten Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang in luftdichtem Behälter und lichtgeschützt bei Raumtemperatur gelagert wurden, entnehmen. Wiegen Sie die Probe, nachdem Sie die Oberflächenflüssigkeit mit Filterpapier adsorbiert haben. nennen wir es Old 1. HINWEIS: Die Masse von Old 1 betrug in diesem Protokoll 42,3 mg.</li>
		<li>Alte Probe 2: Die durch Ethylacetat abgetötete Fliegenprobe herausnehmen und in einem Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang luftdicht verschlossen und lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern. Wiegen Sie und nennen Sie es Alt 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung vor der Extraktion<ol><li>Fügen Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff hinzu, um einen Edelstahlbehälter zu kühlen. Warten Sie, bis der gesamte flüssige Stickstoff verdampft ist.</li>
		<li>Geben Sie eine Fliegenprobe in den Behälter; Gießen Sie den flüssigen Stickstoff langsam ein, um zu verhindern, dass der flüssige Stickstoff spritzt und die Insektenprobe beeinträchtigt.</li>
		<li>Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein. Entnehmen Sie Proben, nachdem der flüssige Stickstoff verdampft ist.</li>
		<li>Den Thorax einzeln abtrennen, in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen geben und in möglichst kleine Scheiben schneiden. HINWEIS: Schneiden Sie die Probe in kleine Stücke, damit sie vollständig gespalten werden kann und die DNA in großen Mengen freigesetzt werden kann.</li>
		<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte für jede Fliege, frieren Sie sie einzeln ein und nehmen Sie sie dann in ein neues Zentrifugenröhrchen, um eine DNA-Kreuzkontamination zu verhindern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA-Extraktion
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur (15-25 °C) in einer Mikrozentrifuge durchgeführt werden. Alle Schritte müssen unter strikter Einhaltung der Grundsätze der Asepsis und zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen durchgeführt werden.
<ol><li>Lyse von Gewebe<ol><li>Geben Sie 180 μl Gewebelysepuffer in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das eine abgeschnittene Probe enthält.</li>
		<li>20 μl Proteinase K zugeben. Durch Vortexen bei 3 000 U/min für 10 s gründlich mischen und bei 56 ΰC inkubieren, bis das Insektengewebe vollständig lysiert ist. HINWEIS: Fügen Sie mehr Proteinase K hinzu, wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut wird. Die Lyse ist in der Regel in 1-3 Stunden abgeschlossen und kann die Lysezeit auch über Nacht verlängern.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA-Präzipitation<ol><li>Vortex bei 3.000 U/min für 15 s. Geben Sie 200 μl Lysepuffer in die Probe und mischen Sie sie gründlich, indem Sie sie 15 s lang bei 3.000 U/min vortexen.</li>
		<li>200 μl Ethanol (96-100%) zugeben und erneut gründlich mischen, indem Sie bei 3.000 U/min 15 s lang vortexen. HINWEIS: Lysepuffer und Ethanol können in einem Schritt vorhinzugefügt werden, um Zeit zu sparen. Unter Zugabe von Lysepuffer und Ethanol kann sich ein weißer Niederschlag bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipettieren Sie die Mischung in die DNA-Adsorptionssäule, die in ein 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird. Bei 6.000 × g 1 min zentrifugieren. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.</li>
	<li>Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule aus dem vorherigen Schritt in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Proteinentfernungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 6.000 × g . Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.</li>
	<li>Übertragen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Entsalzungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 20.000 × g , um die Membran der DNA-Adsorptionssäule zu trocknen. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen. HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt stellt sicher, dass vor der folgenden Elution jegliches Restethanol entfernt wird. Bei einer Verschleppung von Ethanol erneut bei 20.000 × g für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, pipettieren Sie direkt 100 μl DNA-Elutionspuffer auf die Säulenmembran, inkubieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 6.000 × g zur Eluierung. HINWEIS: Die Elution mit 100 μl (statt 200 μl) erhöht die endgültige DNA-Konzentration im Eluat, verringert aber auch die Gesamtausbeute der DNA. Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, wiederholen Sie die Elution einmal, wie in Schritt 2.8 beschrieben.</li>
	<li>Lagern Sie die DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) bzw. -80 °C für die Langzeitlagerung.</li>
</ol>3. Nachweis der DNA-Konzentration
<ol><li>Bestimmen Sie die Werte von OD 260 und OD 280, um die DNA-Reinheit und die Nukleinsäurekonzentration mit dem Mikroplatten-Reader zu vergleichen. Wiederholen Sie dies dreimal für jede Probe.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der extrahierten DNA mit einem Fluorometer mit dem Begleitkit mit drei Replikaten für jede Probe.<ol><li>Nehmen Sie 190 μl Arbeitslösung in zwei 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen, nehmen Sie jeweils 10 μl von Standard #1 und Standard #2, fügen Sie sie zu den Arbeitslösungen hinzu und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang lichtgeschützt. HINWEIS: Standard #1 und Standard #2 sind genau für eine bestimmte DNA-Konzentration kalibriert. Standardlösungen sollten genau konfiguriert werden, um die Bildung einer genauen Standardkurve zu gewährleisten. Standard #1 ist eine 0,2 ng/μl doppelsträngige DNA (dsDNA)-Probe; Standard #2 ist 2.000 ng/μL. Die Arbeitslösung ist ein Farbstoff, der spezifisch an dsDNA bindet.</li>
		<li>Nehmen Sie 2 μl Test-DNA und mischen Sie sie mit 198 μl Arbeitslösung in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang von Licht fern. HINWEIS: Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, fügen Sie 5 μl Test-DNA mit 195 μl Arbeitslösung hinzu.</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät nach 15 Minuten ein und wählen Sie dsDNA-Konzentrationsmessung | Große Reichweite. Testen Sie zuerst Standard #1 und dann Standard #2, um die Standardkurve zu erhalten. HINWEIS: Die Standardlösung muss am selben Tag nach der Konfiguration verwendet werden. Wenn Sie es zu lange belassen, führt dies zu einem großen Fehler in der Standardkurve.</li>
		<li>Legen Sie die zu testenden Proben nacheinander in die Assay-Wells, stellen Sie das DNA-Spike-Volumen auf 2 μl ein, wiederholen Sie die Messung dreimal, nehmen Sie den Durchschnittswert und zeichnen Sie auf.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR und elektrophoretischer Nachweis
HINWEIS: Die mitochondriale CO-Gensequenz <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mit einer Länge von 278 bp wurde für die PCR-Amplifikation mit dem Forward-Primer C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG und dem Reverse-Primer C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8 entnommen, und dann wurde eine 2%ige Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um den Amplifikationseffekt und die Länge der Amplifikationsprodukte zu überprüfen.
<ol><li>Richten Sie 20 μl des PCR-Amplifikationssystems ein, indem Sie 10 μl 2x Taq-Mix, 1 μl jedes Primers, 5 μl ddH2O und 3 μl Template-DNA hinzufügen; 10 s in einer Zentrifuge gut mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusparameter: Prädenaturierung 95 °C für 10 min; Denaturierung 95 °C für 30 s, Glühen 48 °C für 30 s, Ausdehnung 72 °C für 45 s für insgesamt 40 Zyklen; und Endausdehnung 72 °C für 10 min.</li>
	<li>Setzen Sie die Produkte nach der PCR einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese aus und legen Sie sie nach der Elektrophorese zur Photoanalyse auf ein Gel-Imaging-System.</li>
</ol>

Beurteilung der DNA-Reinheit und -Konzentration in frischen und alten nekrophilen Fliegenproben

<ol>
	<li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+entomology:+applications+and+limitations.">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li><li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium.">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li><li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia:+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology.">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li><li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria.">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li><li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology.">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li><li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species.">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li><li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants:+Retrospective,+population+based+diagnostic+evaluation.">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214 (2021).</li><li>Cai, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China.">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li><li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+chitin,+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects.">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li><li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies.">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li><li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures.">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532 (2022).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699 (2011).</li><li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+fluorimetry+(Qubit)+and+spectrophotometry+(NanoDrop)+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients:+A+real-world+use+of+genomic+tests.">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375 (2021).</li><li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+fluorimetry+(Qubit)+and+spectrophotometry+(NanoDrop)+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+(cfDNA)+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients.">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li><li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae,+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length.">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li><li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population.">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li><li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae)+with+emphasis+on+DNA+barcoding:+A+review.">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778 (2023).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die DNA-Extraktion ist das wichtigste Glied bei der molekularen Identifizierung nekrophiler Fliegen, und die Extraktionsmethode und die Qualität der extrahierten DNA wirken sich direkt auf den späteren Nachweis aus. In diesem Experiment haben wir erfolgreich DNA von nekrophilen Fliegen extrahiert, indem wir ein gängiges Blutkit verwendet haben, ohne dass ein spezielles Insekten-DNA-Extraktionskit gekauft werden musste, was die Extraktion von Insekten-DNA erleichtert.
Die Oberfläche der Fli...

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Die Schlussfolgerung des Todeszeitpunkts war schon immer eine der zentralen und schwierigsten Fragen, die in der gerichtlichen Praxis zu lösen waren. In der Praxis der Forensik spielt die Bestimmung des postmortalen Intervalls bei einem Kriminalfall eine entscheidende Rolle bei der Ableitung des Tatzeitpunkts, der Eingrenzung des Verdächtigen und der Eingrenzung des Ermittlungsumfangs. Traditionelle Methoden zur Ableitung des Todeszeitpunkts beruhen in erster Linie auf frühen postmortalen Phänomenen, die in der Regel nur zur Ableitung des Todeszeitpunkts innerhalb von 24 Stunden herangezogen werden können. Die lange Zeit des Todes kann jedoch nicht durch postmortale Phänomene bestimmt werden. In der forensischen Gemeinschaft ist inzwischen allgemein anerkannt, dass die forensische Entomologie das Potenzial hat, eine effektive Methode zu sein, um auf eine längere Todeszeit zu schließen.
Nekrophage Insekten sind nach ihren Larven benannt, die sich von Leichen ernähren. Wenn eine Leiche vorhanden ist, sind die erwachsenen nekrophilen Fliegen die ersten, die den Leichnam erreichen und ihre Eier oder Larven ablegen. Die Larven ernähren sich von Leichengewebe und reifen zu Puppen heran, die zu erwachsenen Tieren flügge werden. Nekrophile Fliegen spielen in der Praxis der Forensik eine große Rolle, da sie regelmäßig leben und geographisch verteilt sind, z. B. bei der Ableitung des Todeszeitpunkts und der Bestimmung des Todesortes 1,2. Das Hindernis für den Einsatz nekrophiler Fliegen in der forensischen Praxis ist jedoch die Artbestimmung. Morphologische Methoden werden nach wie vor als maßgebliche Methode zur Artbestimmung von nekrophilen Fliegen verwendet. Die morphologische Artbestimmung erfordert jedoch ein hohes Maß an Integrität der Insekten. Wenn sich die Fliegen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien befanden oder aufgrund morphologischer Veränderungen, die durch Umweltentscheidungen verursacht wurden, erschwert dies alle die morphologische Untersuchung. Insbesondere die Morphologie der Puppen und Puppenpanzer, die am häufigsten am Tatort zu finden sind, ist kaum noch zu erkennen. Dies, zusammen mit dem Mangel an morphologischen Experten, erschwert die morphologische Identifizierung von Arten enorm. Daher hat sich die Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Artbestimmung von Fliegen herausgebildet, die die Schwierigkeit der morphologischen Identifizierung reduziert und unabhängig vom Entwicklungsstadiumist 3,4,5,6,7.
Der erste Schritt bei der Artenbestimmung nekrophiler Fliegen auf der Grundlage molekularbiologischer Methoden ist die effiziente Extraktion von DNA, während spezielle Kits für die Extraktion von Insekten-DNA derzeit nicht allgemein verfügbar sind. Und die Verwendung gängiger Blutkits für die DNA-Extraktion von nekrophilen Fliegen wird forensisch immer relevanter. Nekrophile Fliegen, die an Tatorten gefunden werden, sind oft verstümmelt oder haben Verwesung und DNA-Abbau erfahren. Fliegenproben stehen nach der Entnahme nicht sofort für die DNA-Extraktion zur Verfügung, oder wenn möglich, müssen vollständige Proben aufgrund von Anforderungen an die Beweissicherung aufbewahrt werden. Basierend auf den oben genannten Anforderungen haben wir in dieser Studie das Blut-DNA-Kit auf der Grundlage des Proteinase-K-Verdschlusses angewendet und drei frische Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) Proben ausgewählt (Abbildung 1), eine alte C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang lichtgeschützt gelagert wurde, wogen jede der fünf Proben, wählte das Thoraxgewebe von Insekten für die DNA-Extraktion aus. Beim Vergleich der Qualität und Reinheit der DNA, die aus der alten und der neuen Probe extrahiert wurde, wurden PCR-Amplifikation und Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO-Gensequenz <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> befinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer AE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172026832</td>
			<td>DNA elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028374</td>
			<td>lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer ATL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028162</td>
			<td>tissue lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AW1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028760</td>
			<td>protein removal buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AW2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57203108</td>
			<td>desalination buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1-J-2495</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109216</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1-N-2800</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109217</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Mini spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>166050343</td>
			<td>DNA adsorption column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>DKT200-2D</td>
			<td>used for heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172026218</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2321611188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard#1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard#2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Working Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna extraction and comparison between old and fresh necrophilic fly samples

Insgesamt wurden fünf Proben von Chrysomya megacephala-Proben - drei frische Proben, eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine Probe, die 2 Jahre lang in trockener, versiegelter Lagerung nur lichtgeschützt gelagert wurde - ausgewählt, um zu untersuchen, ob ein Blut-DNA-Extraktionskit DNA von nekrophilen Fliegen extrahieren kann und ob Alkohol die Konservierung der DNA von nekrophilen Fliegen verlängern kann. Zunächst wurde das Blut-DNA-Extraktionskit verwendet, um DNA aus ihrem Thoraxgewebe zu extrahieren. Anschließend wurden die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Mikroplatten-Reader und einem Fluorometer untersucht. Schließlich wurden die PCR-Amplifikation und die Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO I-Gensequenz befanden. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA-Reinheit aller Proben größer als 2,0 war. Es wurde festgestellt, dass die DNA-Konzentration in der folgenden Größenordnung liegt: frische Proben > alkoholkonservierte alte Proben > unbehandelte, alte Proben. Alle Proben wiesen nach PCR-Amplifikation spezifische elektrophoretische Banden auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Blut-DNA-Extraktionskit verwendet werden kann, um DNA aus nekrophilen Fliegen erfolgreich zu extrahieren, und die DNA-Konzentration frischer Fliegenproben ist höher als die alter Fliegenproben. Die Fliegen können lange in Alkohol gelagert werden.

The inference of the time of death has always been one of the key and difficult issues to be resolved in judicial practice. In the practice of forensic science, for a criminal case, determining postmortem interval plays a crucial role in deducing the time of the crime, locking in the suspect, and narrowing the scope of the investigation. Traditional methods of inferring the time of death are based primarily on early postmortem phenomena, which can generally only be used to infer the time of death within 24 h. However, the long time of death cannot be determined by postmortem phenomena. It is now generally recognized in the forensic science community that forensic entomology has the potential to be an effective method of inferring a longer time of death.
Necrophagous insects are named for their larvae that feed on corpses. Among them, whenever a corpse is present, the adult necrophilous flies will be the first to reach the corpse and lay their eggs or larvae. The larvae feed on corpse tissue and mature into pupae, which fledge into adults. Necrophilic flies play a huge role in the practice of forensic science because of their regular life cycle and geographic distribution, for example, deducting the time of death and determining the place of death1,2. However, the barrier to the use of necrophilous flies in forensic practice is species identification. Morphological methods are still used as the authoritative method for species identification of necrophilous flies. However, morphological species identification requires a high degree of insect integrity. If the flies were in different developmental stages, or due to morphological changes caused by environmental choices, those all make morphological examination more difficult. In particular, the morphology of pupae and pupal shells, which are most often found at the crime scene, is barely recognizable. This, together with the scarcity of morphological experts, makes huge difficulty to the identification of species morphologically. Therefore, the application of molecular biology methods for species identification of flies has emerged, which reduces the difficulty of morphological identification and is independent of developmental stage3,4,5,6,7.
The first step in species identification of necrophilous flies based on molecular biology methods is the efficient extraction of DNA, while specialized kits for insect DNA extraction are not commonly available currently. And how to use common blood kits for DNA extraction of necrophilic flies becomes more forensically relevant. Necrophilic flies found at crime scenes are often mutilated or have undergone decay and DNA degradation. Fly samples are not immediately available for DNA extraction after acquisition, or if possible, complete samples need to be retained due to evidence preservation requirements. Based on the above requirements, in this study, we applied the blood DNA kit based on proteinase K digestion, and selected three fresh Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) samples (Figure 1), one old C. megacephala sample placed in alcohol for two years, and one C. megacephala sample placed in light-protected storage for two years, weighed each of the five samples, elected the insect thorax tissue for DNA extraction. Comparing the quality and purity of DNA extracted from the old and new samples, PCR amplification and electrophoresis of the extracted DNA were performed with necrophilic fly-specific primers located in the mitochondrial CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> gene sequence.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der DNA-Extraktion aus nekrophilen Fliegenproben mit einfacher Technik

DNA-Extraktion und Vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen Fliegenproben

Wir verwendeten ein Mikroplatten-Reader, um die Werte von OD260 und OD280 der extrahierten DNA-Lösung zu messen, und erhielten dann die OD260/OD280-Werte, um die Reinheit der DNA zu bewerten. Der OD260/OD280 aller frischen Proben und der alten Probe 1 war größer als 2. Der OD260/OD280 der alten Stichprobe 2 hatte einen Maximalwert von 2,187, obwohl der Durchschnitt bei 1,753 lag, und seine drei Messungen schwankten stark aufgrund der geringen (≤0,01) Werte sowohl des OD280 als auch des OD280 (Tabelle 1</stro...

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Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion frischer und alter nekrophiler Fliegen-DNA unter Verwendung eines modifizierten gängigen DNA-Extraktionskits.

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

294 Aufrufe.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). Unser Partikel zielt darauf ab, Fliegen-DNA einfach und bequem zu extrahieren und die DNA-Konzentrationen zwischen neuen und alten Proben von nekrophilen Fliegen zu vergleichen. Wir versuchen zu untersuchen, ob Blut-DNA-Extraktionskits effektiv DNA aus Fliegen extrahieren, und gibt es eine Änderung zwischen den DNA-Konzentrationen aus neuen und alten Proben von nekrophilen Fliegen? Wir stellten eine Methode zur Extraktion von Fliegen-DNA mit gewöhnlichen Bl...

Serie: Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der DNA-Extraktion aus nekrophilen Fliegenproben mit einfacher Technik

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry sealed storage for 2 years protected from light only - were selected to investigate whether a blood DNA extraction kit could extract DNA from necrophilous flies and to determine whether alcohol could prolong the preservation of necrophilous flies&#39; DNA. First, the blood DNA extraction kit was used to extract DNA from their thorax tissues. Then, the DNA purity and concentration were examined using a microplate reader and a fluorometer. Finally, PCR amplification and electrophoresis of the extracted DNA were done with necrophilic fly-specific primers located in the mitochondrial CO I gene sequence. The results showed that the DNA purity of all samples was greater than 2.0. The DNA concentration was observed to be of the following order: fresh samples &#62; alcohol-preserved old samples &#62; untreated, old samples. All samples had specific electrophoretic bands after PCR amplification. In conclusion, a blood DNA extraction kit can be used to extract DNA from necrophilic flies successfully, and the DNA concentration of fresh fly samples is greater than that of old fly samples. The flies can be stored in alcohol for a long time.

This article describes a protocol for fresh and old necrophilic fly DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.