Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).

NOTA: In questo protocollo sono stati utilizzati un totale di cinque campioni di C. megacephala : tre campioni freschi (Fresh 1, Fresh 2 e Fresh 3), un campione conservato in alcool per 2 anni (Old 1) e un campione conservato in una conservazione sigillata a secco per 2 anni al riparo dalla luce (Old 2). I campioni devono essere etichettati secondo i requisiti sperimentali.
1. Conservazione e preparazioni generali dei campioni
<ol><li>Selezione e preparazione dei campioni NOTA: Assicurarsi di lavorare nella cappa aspirante quando si applica l'acetato di etile per eseguire mosche necrofaghe. Rimuovere il liquido dalla superficie della mosca prima di pesare.<ol><li>Campioni freschi: Mettere tre campioni di mosche raccolti in fiale di gas dopo averle uccise con acetato di etile. Pesare e denominare i campioni come Fresh 1, Fresh 2 e Fresh 3 e utilizzarli immediatamente negli esperimenti. NOTA: I campioni di mosca fresca in questo protocollo avevano masse di 56,8 mg, 49,3 mg e 52,1 mg.</li>
		<li>Vecchio campione 1: Prelevare campioni di mosca uccisi dall'acetato di etile e conservati in provette da centrifuga riempite di alcol per 2 anni in contenimento ermetico, al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Pesare il campione dopo aver adsorbito il liquido superficiale con carta da filtro; chiamalo Vecchio 1. NOTA: La massa di Old 1 era di 42,3 mg in questo protocollo.</li>
		<li>Vecchio campione 2: Estrarre il campione di mosca ucciso dall'acetato di etile e conservato in una provetta da centrifuga per 2 anni in contenimento ermetico, al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Pesa e chiamalo Vecchio 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione prima dell'estrazione<ol><li>Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un contenitore di acciaio inossidabile; Attendere che tutto l'azoto liquido sia evaporato.</li>
		<li>Metti un campione di mosca nel contenitore; Versare lentamente l'azoto liquido per evitare che l'azoto liquido schizzi e colpisca il campione di insetto.</li>
		<li>Congelare i campioni in azoto liquido. Rimuovere i campioni dopo che l'azoto liquido è evaporato.</li>
		<li>Separare il torace singolarmente, metterlo in una provetta da centrifuga da 2 ml e tagliarlo a fette il più piccole possibile. NOTA: Tagliare il campione in piccoli pezzi in modo che possa essere completamente tagliato e il DNA possa essere rilasciato in grandi quantità.</li>
		<li>Ripetere i passaggi precedenti per ogni mosca, congelare singolarmente e quindi rimuoverla in una nuova provetta da centrifuga per prevenire la contaminazione incrociata del DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione del DNA
NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione devono essere eseguite a temperatura ambiente (15-25 °C) in una microcentrifuga. Tutti i passaggi devono essere eseguiti nel rigoroso rispetto dei principi dell'asepsi e per evitare la contaminazione incrociata.
<ol><li>Lisi tissutale<ol><li>Aggiungere 180 μl di tampone per lisi tissutale a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente un campione clippato.</li>
		<li>Aggiungere 20 μl di proteinasi K. Mescolare accuratamente agitando a 3 000 giri/min per 10 s e incubare a 56 °C fino a quando i tessuti degli insetti non sono completamente lisati. NOTA: Aggiungere più proteinasi K se il tessuto non è completamente digerito. La lisi è solitamente completa in 1-3 ore, inoltre può prolungare il tempo di lisi durante la notte.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitazione del DNA<ol><li>Vortice a 3.000 giri/min per 15 s. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al campione e mescolare accuratamente agitando a 3.000 giri/min per 15 s.</li>
		<li>Aggiungere 200 μl di etanolo (96-100%) e mescolare nuovamente accuratamente vorticando a 3.000 giri/min per 15 s. NOTA: Il tampone di lisi e l'etanolo possono essere preaggiunti insieme in un unico passaggio per risparmiare tempo. Un precipitato bianco può formarsi con l'aggiunta di tampone di lisi ed etanolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserire la miscela nella colonna di adsorbimento del DNA posta in una provetta di raccolta da 2 mL. Centrifugare a 6.000 × g per 1 min. Scartare il flusso di passaggio e la provetta di raccolta.</li>
	<li>Posizionare la colonna di adsorbimento del DNA della fase precedente in una nuova provetta di raccolta da 2 mL, aggiungere 500 μl di tampone per la rimozione delle proteine e centrifugare a 6.000 × g per 1 minuto. Scartare il flusso di passaggio e la provetta di raccolta.</li>
	<li>Trasferire la colonna di adsorbimento del DNA in una nuova provetta di raccolta da 2 mL, aggiungere 500 μl di tampone di desalinizzazione e centrifugare a 20.000 × g per 3 minuti per asciugare la membrana della colonna di adsorbimento del DNA. Scartare il flusso di passaggio e la provetta di raccolta. NOTA: Questa fase di centrifugazione garantisce la rimozione di eventuali residui di etanolo prima della successiva eluizione. In caso di riporto di etanolo, centrifugare nuovamente a 20.000 × g per 1 minuto.</li>
	<li>Posizionare la colonna di adsorbimento del DNA in una provetta da microcentrifuga pulita da 2 mL, pipettare direttamente 100 μl di tampone di eluizione del DNA sulla membrana della colonna, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto e quindi centrifugare a 6.000 × g per 1 minuto per eluire. NOTA: L'eluizione con 100 μL (invece di 200 μL) aumenta la concentrazione finale di DNA nell'eluato, ma diminuisce anche la resa complessiva del DNA. Per massimizzare la resa del DNA, ripetere l'eluizione una volta come descritto al punto 2.8.</li>
	<li>Conservare i campioni di DNA a 4 °C (fino a 1 settimana) o -80 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>3. Rilevamento della concentrazione di DNA
<ol><li>Determinare i valori di OD 260 e OD 280 per confrontare la purezza del DNA e la concentrazione di acido nucleico mediante lettore di micropiastre. Ripetere tre volte su ogni campione.</li>
	<li>Determinare la concentrazione del DNA estratto mediante fluorimetro utilizzando il kit complementare, con tre repliche per ogni campione.<ol><li>Prelevare 190 μL di soluzione di lavoro in due provette da centrifuga da 0,5 mL, prelevare 10 μL ciascuno di Standard #1 e Standard #2, aggiungerli alle soluzioni di lavoro e tenerli al riparo dalla luce per non meno di 15 minuti. NOTA: Lo standard #1 e lo standard #2 sono accuratamente calibrati per una certa concentrazione di DNA. Le soluzioni standard devono essere configurate accuratamente per garantire la formazione di una curva standard accurata. Lo standard #1 è un campione di DNA a doppio filamento (dsDNA) da 0,2 ng/μL; lo standard #2 è di 2.000 ng/μL. La soluzione funzionante è un colorante che si lega specificamente al dsDNA.</li>
		<li>Prelevare 2 μL di DNA in esame e mescolarlo con 198 μL di soluzione di lavoro in una provetta da centrifuga da 0,5 mL e tenerlo lontano dalla luce per non meno di 15 minuti. NOTA: Se la concentrazione di DNA è bassa, aggiungere 5 μL di DNA di prova con 195 μL di soluzione di lavoro.</li>
		<li>Dopo 15 minuti, accendere lo strumento e selezionare Misurazione della concentrazione di dsDNA | Lungo raggio. Innanzitutto, testare lo standard #1 e poi lo standard #2 per ottenere la curva standard. NOTA: La soluzione standard deve essere utilizzata lo stesso giorno successivo alla configurazione; Lasciarlo troppo a lungo comporterà un grosso errore nella curva standard.</li>
		<li>Posizionare i campioni da analizzare nei pozzetti del saggio uno per uno, regolare il volume di picco del DNA a 2 μl, ripetere la misurazione tre volte, prendere il valore medio e registrare.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PCR e rilevamento elettroforetico
NOTA: La sequenza del gene CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitocondriale con una lunghezza di 278 bp è stata prelevata per l'amplificazione PCR con il primer diretto C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG e il primer inverso C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, e quindi è stata eseguita l'elettroforesi su gel di agarosio al 2% per verificare l'effetto di amplificazione e la lunghezza dei prodotti di amplificazione.
<ol><li>Impostare 20 μL del sistema di amplificazione PCR aggiungendo 10 μL di miscela 2x Taq, 1 μL di ciascun primer, 5 μL di ddH2O e 3 μL di DNA stampo; Mescolare bene per 10 s in una centrifuga.</li>
	<li>Utilizzare i seguenti parametri del ciclo PCR: predenaturazione 95 °C per 10 min; denaturazione 95 °C per 30 s, ricottura 48 °C per 30 s, prolunga 72 °C per 45 s per un totale di 40 cicli; e prolungamento finale 72 °C per 10 min.</li>
	<li>Sottoporre i prodotti dopo la PCR all'elettroforesi su gel di agarosio al 2% e, dopo l'elettroforesi, posizionarli su un sistema di imaging su gel per l'analisi fotografica.</li>
</ol>

Valutazione della purezza e della concentrazione del DNA in campioni di mosche necrofile fresche e vecchie

<ol>
	<li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+entomology:+applications+and+limitations.">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li><li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium.">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li><li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia:+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology.">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li><li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria.">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li><li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology.">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li><li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species.">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li><li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants:+Retrospective,+population+based+diagnostic+evaluation.">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214 (2021).</li><li>Cai, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China.">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li><li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+chitin,+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects.">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li><li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies.">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li><li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures.">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532 (2022).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699 (2011).</li><li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+fluorimetry+(Qubit)+and+spectrophotometry+(NanoDrop)+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients:+A+real-world+use+of+genomic+tests.">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375 (2021).</li><li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+fluorimetry+(Qubit)+and+spectrophotometry+(NanoDrop)+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+(cfDNA)+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients.">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li><li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae,+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length.">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li><li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population.">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li><li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae)+with+emphasis+on+DNA+barcoding:+A+review.">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778 (2023).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'estrazione del DNA è l'anello più critico nell'identificazione molecolare delle mosche necrofile e il suo metodo di estrazione e la qualità del DNA estratto influenzano direttamente la successiva rilevazione. In questo esperimento, abbiamo estratto con successo il DNA dalle mosche necrofile utilizzando un comune kit di sangue, senza la necessità di acquistare uno speciale kit di estrazione del DNA degli insetti, che rende l'estrazione del DNA degli insetti più facile da realizzare.
La s...

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

La deduzione dell'ora della morte è sempre stata una delle questioni chiave e difficili da risolvere nella pratica giudiziaria. Nella pratica delle scienze forensi, per un caso penale, determinare l'intervallo post-mortem gioca un ruolo cruciale nel dedurre l'ora del crimine, bloccare il sospetto e restringere l'ambito dell'indagine. I metodi tradizionali per dedurre l'ora della morte si basano principalmente su fenomeni post-mortem precoci, che generalmente possono essere utilizzati solo per dedurre l'ora della morte entro 24 ore. Tuttavia, il lungo periodo della morte non può essere determinato da fenomeni post mortem. È ora generalmente riconosciuto nella comunità delle scienze forensi che l'entomologia forense ha il potenziale per essere un metodo efficace per dedurre un tempo di morte più lungo.
Gli insetti necrofagi prendono il nome dalle loro larve che si nutrono di cadaveri. Tra questi, ogni volta che è presente un cadavere, le mosche necrofile adulte saranno le prime a raggiungere il cadavere e deporre le uova o le larve. Le larve si nutrono di tessuto cadaverico e maturano in pupe, che si involano negli adulti. Le mosche necrofile svolgono un ruolo enorme nella pratica della scienza forense a causa del loro ciclo di vita regolare e della distribuzione geografica, ad esempio deducendo l'ora della morte e determinando il luogo della morte 1,2. Tuttavia, l'ostacolo all'uso di mosche necrofile nella pratica forense è l'identificazione delle specie. I metodi morfologici sono ancora utilizzati come metodo autorevole per l'identificazione delle specie di mosche necrofile. Tuttavia, l'identificazione morfologica delle specie richiede un alto grado di integrità degli insetti. Se le mosche si trovavano in diversi stadi di sviluppo, o a causa di cambiamenti morfologici causati da scelte ambientali, tutto ciò rende più difficile l'esame morfologico. In particolare, la morfologia delle pupe e dei gusci pupali, che si trovano più spesso sulla scena del crimine, è a malapena riconoscibile. Questo, insieme alla scarsità di esperti morfologici, rende estremamente difficile l'identificazione morfologica delle specie. Pertanto, è emersa l'applicazione di metodi di biologia molecolare per l'identificazione delle specie di mosche, che riduce la difficoltà di identificazione morfologica ed è indipendente dallo stadio di sviluppo 3,4,5,6,7.
Il primo passo nell'identificazione delle specie di mosche necrofile basata su metodi di biologia molecolare è l'estrazione efficiente del DNA, mentre attualmente non sono comunemente disponibili kit specializzati per l'estrazione del DNA degli insetti. E come utilizzare i comuni kit di sangue per l'estrazione del DNA delle mosche necrofile diventa più rilevante dal punto di vista forense. Le mosche necrofile trovate sulle scene del crimine sono spesso mutilate o hanno subito carie e degradazione del DNA. I campioni di mosca non sono immediatamente disponibili per l'estrazione del DNA dopo l'acquisizione o, se possibile, i campioni completi devono essere conservati a causa dei requisiti di conservazione delle prove. Sulla base dei requisiti di cui sopra, in questo studio, abbiamo applicato il kit di DNA del sangue basato sulla digestione della proteinasi K e selezionato tre campioni freschi di Chrysomya megacephala (Ditteri, Lepidotteri) (Figura 1), un vecchio campione di C. megacephala posto in alcol per due anni e un campione di C. megacephala posto in una conservazione protetta dalla luce per due anni, pesato ciascuno dei cinque campioni, eletto il tessuto toracico dell'insetto per l'estrazione del DNA. Confrontando la qualità e la purezza del DNA estratto dai campioni vecchi e nuovi, l'amplificazione PCR e l'elettroforesi del DNA estratto sono state eseguite con primer specifici per mosche necrofile situati nella sequenza genica mitocondriale del CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer AE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172026832</td>
			<td>DNA elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028374</td>
			<td>lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer ATL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028162</td>
			<td>tissue lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AW1</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172028760</td>
			<td>protein removal buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AW2</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>57203108</td>
			<td>desalination buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1-J-2495</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109216</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1-N-2800</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109217</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Mini spin column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>166050343</td>
			<td>DNA adsorption column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>DKT200-2D</td>
			<td>used for heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>172026218</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2321611188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard#1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard#2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Working Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2342797</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna extraction and comparison between old and fresh necrophilic fly samples

Un totale di cinque campioni di Chrysomya megacephala - tre campioni freschi, un campione conservato in alcol per 2 anni e un campione conservato in un deposito sigillato a secco per 2 anni protetto solo dalla luce - sono stati selezionati per indagare se un kit di estrazione del DNA del sangue potesse estrarre il DNA dai moscerini necrofili e per determinare se l'alcol potesse prolungare la conservazione del DNA dei moscerini necrofili. In primo luogo, il kit di estrazione del DNA del sangue è stato utilizzato per estrarre il DNA dai tessuti del torace. Quindi, la purezza e la concentrazione del DNA sono state esaminate utilizzando un lettore di micropiastre e un fluorimetro. Infine, l'amplificazione PCR e l'elettroforesi del DNA estratto sono state eseguite con primer necrofili specifici per la mosca situati nella sequenza genica mitocondriale CO I. I risultati hanno mostrato che la purezza del DNA di tutti i campioni era superiore a 2,0. È stato osservato che la concentrazione di DNA era del seguente ordine: campioni freschi > vecchi campioni conservati in alcool > vecchi campioni non trattati. Tutti i campioni avevano bande elettroforetiche specifiche dopo l'amplificazione della PCR. In conclusione, un kit per l'estrazione del DNA del sangue può essere utilizzato per estrarre con successo il DNA dalle mosche necrofile e la concentrazione di DNA dei campioni di mosca freschi è maggiore di quella dei vecchi campioni di mosca. Le mosche possono essere conservate a lungo nell'alcool.

The inference of the time of death has always been one of the key and difficult issues to be resolved in judicial practice. In the practice of forensic science, for a criminal case, determining postmortem interval plays a crucial role in deducing the time of the crime, locking in the suspect, and narrowing the scope of the investigation. Traditional methods of inferring the time of death are based primarily on early postmortem phenomena, which can generally only be used to infer the time of death within 24 h. However, the long time of death cannot be determined by postmortem phenomena. It is now generally recognized in the forensic science community that forensic entomology has the potential to be an effective method of inferring a longer time of death.
Necrophagous insects are named for their larvae that feed on corpses. Among them, whenever a corpse is present, the adult necrophilous flies will be the first to reach the corpse and lay their eggs or larvae. The larvae feed on corpse tissue and mature into pupae, which fledge into adults. Necrophilic flies play a huge role in the practice of forensic science because of their regular life cycle and geographic distribution, for example, deducting the time of death and determining the place of death1,2. However, the barrier to the use of necrophilous flies in forensic practice is species identification. Morphological methods are still used as the authoritative method for species identification of necrophilous flies. However, morphological species identification requires a high degree of insect integrity. If the flies were in different developmental stages, or due to morphological changes caused by environmental choices, those all make morphological examination more difficult. In particular, the morphology of pupae and pupal shells, which are most often found at the crime scene, is barely recognizable. This, together with the scarcity of morphological experts, makes huge difficulty to the identification of species morphologically. Therefore, the application of molecular biology methods for species identification of flies has emerged, which reduces the difficulty of morphological identification and is independent of developmental stage3,4,5,6,7.
The first step in species identification of necrophilous flies based on molecular biology methods is the efficient extraction of DNA, while specialized kits for insect DNA extraction are not commonly available currently. And how to use common blood kits for DNA extraction of necrophilic flies becomes more forensically relevant. Necrophilic flies found at crime scenes are often mutilated or have undergone decay and DNA degradation. Fly samples are not immediately available for DNA extraction after acquisition, or if possible, complete samples need to be retained due to evidence preservation requirements. Based on the above requirements, in this study, we applied the blood DNA kit based on proteinase K digestion, and selected three fresh Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) samples (Figure 1), one old C. megacephala sample placed in alcohol for two years, and one C. megacephala sample placed in light-protected storage for two years, weighed each of the five samples, elected the insect thorax tissue for DNA extraction. Comparing the quality and purity of DNA extracted from the old and new samples, PCR amplification and electrophoresis of the extracted DNA were performed with necrophilic fly-specific primers located in the mitochondrial CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;" /> gene sequence.

Autore in primo piano: Avanzamento dell'estrazione del DNA da campioni di mosche necrofile utilizzando una tecnica semplice

Estrazione del DNA e confronto tra campioni di mosca necrofila vecchi e freschi

Our particle aims to extract fly DNA simply and conveniently, and compare the DNA concentrations between new and old samples of necrophilic flies. We're trying investigating whether blood DNA extraction kits effectively extract DNA from fly, and is there a change between DNA concentrations from new and old sample of necrophilic flies? We provided a method for extracting fly DNA using ordinary blood test kits, which solved the problem of expensive and scarce insect extraction kits, and paved the way for molecular biology analysis of these sets.After solving the problem of extracting fly DNA, necrophilic flies to avert the time of death.

Abbiamo utilizzato un lettore di micropiastre per misurare i valori di OD260 e OD280 della soluzione di DNA estratta e quindi abbiamo ottenuto i valori OD260/OD280 per valutare la purezza del DNA. L'OD260/OD280 di tutti i campioni freschi e del vecchio campione 1 era maggiore di 2. L'OD260/OD280 del vecchio campione 2 aveva un valore massimo di 2,187 anche se la media era 1,753 e le sue tre misurazioni fluttuavano notevolmente a causa dei piccoli valori (≤0,01) sia del suo OD280 che dell'OD280 (Tabella 1</stron...

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Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA di mosche necrofile fresche e vecchie utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

277 Views.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). La nostra particella mira a estrarre il DNA del moscerino in modo semplice e conveniente e a confrontare le concentrazioni di DNA tra campioni nuovi e vecchi di mosche necrofile. Stiamo cercando di indagare se i kit per l'estrazione del DNA del sangue estraggono efficacemente il DNA dalla mosca e se c'è un cambiamento tra le concentrazioni di DNA da campioni nuovi e vecchi di mosche necrofile? Abbiamo fornito un metodo per estrarre il DNA di una mosca utiliz...

Video: Autore in primo piano: Avanzamento dell'estrazione del DNA da campioni di mosche necrofile utilizzando una tecnica semplice

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry sealed storage for 2 years protected from light only - were selected to investigate whether a blood DNA extraction kit could extract DNA from necrophilous flies and to determine whether alcohol could prolong the preservation of necrophilous flies&#39; DNA. First, the blood DNA extraction kit was used to extract DNA from their thorax tissues. Then, the DNA purity and concentration were examined using a microplate reader and a fluorometer. Finally, PCR amplification and electrophoresis of the extracted DNA were done with necrophilic fly-specific primers located in the mitochondrial CO I gene sequence. The results showed that the DNA purity of all samples was greater than 2.0. The DNA concentration was observed to be of the following order: fresh samples &#62; alcohol-preserved old samples &#62; untreated, old samples. All samples had specific electrophoretic bands after PCR amplification. In conclusion, a blood DNA extraction kit can be used to extract DNA from necrophilic flies successfully, and the DNA concentration of fresh fly samples is greater than that of old fly samples. The flies can be stored in alcohol for a long time.

This article describes a protocol for fresh and old necrophilic fly DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

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Preparation of Necrophilic Fly Samples for DNA Extraction

To begin, sacrifice flies with ethyl acetate, and place the samples in three gas vials. Weigh the samples, and label them as fresh one, two, and three. Next, retrieve 2-year-old samples stored in alcohol filled centrifuge tubes, and absorb surface liquid with filter paper and weigh the samples.Also, retrieve 2-year-old samples stored in centrifuge tubes and weigh them. Then, add a small amount of liquid nitrogen to a stainless steel container, and wait until all liquid nitrogen has evaporated. Place a fly sample in the container, and slowly pour liquid nitrogen.Freeze the samples in liquid nitrogen, and remove them after the liquid nitrogen evaporates. Separate the thorax individually, followed by slicing each thorax. Place the slices in a two milliliter centrifuge tube.

Preparazione di campioni di mosca necrofila per l'estrazione del DNA

DNA Extraction from Necrophilic Fly Samples

To begin place the clipped fly thorax samples in a two-milliliter centrifuge tube. Add 180 microliters of tissue lysis buffer to the tube, followed by 20 microliters of Proteinase K.Vortex thoroughly at 3, 000 RPM for 10 seconds and incubate at 56 degrees Celsius until tissues are lysed. After incubation, vortex the samples again for 15 seconds.Add 200 microliters of lysis buffer, and mix thoroughly by vortexing. Then add 200 microliters of ethanol and vortex again for 15 seconds. Next, place a DNA absorption column in a two-milliliter collection tube and pipette the mixture into the column.Centrifuge at 6, 000 G for one minute. Discard flow through and the collection tube. Place the column in a new tube and add 500 microliters of protein removal buffer.Centrifuge for one minute and discard the flow through. Transfer the column to a new tube. Add 500 microliters of desalination buffer and centrifuge at 20, 000 G for three minutes to dry the membrane.Then add 100 microliters of DNA elution buffer onto the membrane. Incubate a room temperature for one minute and then centrifuge at 6, 000 G for one minute to elute the DNA. Store the DNA samples as appropriate.

Estrazione del DNA da campioni di mosche necrofile

Qualitative and Quantitative Analysis of DNA Extracted from Fly Samples

To begin, extract DNA from fly samples using a DNA extraction kit. Then use a microplate reader to determine the values of OD260 and OD280 to compare DNA purity and nucleic acid concentration. Next, prepare fluorometer standard solutions by adding 190 microliters of working solution to two 0.5 milliliters centrifuge tubes.Then add 10 microliters each of standard one and standard two to the working solutions. Keep the tubes away from light for at least 15 minutes. Mix two microliters of test DNA with 198 microliters of working solution in a 0.5 milliliter centrifuge tube and keep the mixture in the dark for at least 15 minutes.After 15 minutes, turn on the fluorometer and select the dsDNA concentration measurement, long range setting. Test standard one and standard two to obtain the standard curve. Then place the samples to be tested in the assay wells.Adjust the DNA spiking volume to two microliters and perform the measurement. To visualize the DNA first set up 20 microliters of the PCR amplification reaction. Place the tubes in a thermal cycler and run the PCR cycles.After PCR, subject the products to 2%agarose gel electrophoresis. Then place the gel on a gel imaging system for photo analysis. Assessment of extracted DNA purity by Microplate reader showed that all fresh samples and old sample one had OD260 to OD280 ratios above two.In contrast, old sample two displayed a lower ratio. DNA concentration derived from OD260 readings was highest in fresh samples, followed by old sample one and lowest in old sample two. Electrophoretic analysis revealed bands in the range of 250 to 400 base pairs, which were more pronounced in fresh samples, compared to old ones.