Wir bedanken uns bei Emily A. Kelly für den Kopf-Bauweise. Wir sind dankbar für die Unterstützung des NIH Auszeichnungen an HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 und die großzügige Unterstützung der Geoffrey Waasdorp Neuropädiatrie Fund, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. AKM wird durch die NIH (EY019277), Whitehall-Stiftung, der Alfred P. Sloan Foundation und ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund finanziert. MET wird von einem Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Postdoc-Preis finanziert. DFM ist ein Auszubildender im Medical Scientist Training Program, durch NIH T32 und T32 GM07356 AI049815 finanziert.

1. Vorbereitung der Tiere für Imaging <ol><li> In unseren Experimenten verwenden wir Erwachsenen CX 3 CR 1 GFP / + Mäusen, die ausdrückliche GFP in mononukleären Zelllinien, darunter Mikroglia. 4 verschiedene Stämme von Mäusen verwendet, um die Bedürfnisse eines spezifischen Projekts zugeschnitten werden können. </li><li> Anesthetize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von drei Medikamenten-Cocktail, bestehend aus 0,05 mg / kg Fentanyl, 5,0 mg / kg Midazolam und 0,5 mg / kg Medetomidin. 5 Chirurgische Vorbereitung TSCW beginnt, nachdem das Tier reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie wie ein Schwanz kneifen. Während der Operation und Bildgebung, halten wir das Tier auf einem Heizkissen auf post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. Falls notwendig, eine Auffrischimpfung mit einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail gegeben, um die ursprüngliche Betäubung Flugzeug wiederherzustellen. </li><li> Deckel die Augen des Tieres mit einem schützenden Augensalbe zu halten die Augen feucht während der Narkose unterdrückt, die das Tier Blinkreflex. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut des Tieres mit einer Rasierklinge, Schere, Schere, oder chemische Methoden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% PVP-Jod-Lösung und 70% Ethanol. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert, sterilisiert werden mit einem Glas-Bead-Sterilisator oder desinfiziert mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt der Kopfhaut mit einer kleinen Schere, beginnend 4-5 mm kaudal der Schädelbasis und Weiterentwicklung uns auf die vor den Augen. Es ist wichtig, dass dieser Einschnitt lange genug, dass die Haut nicht mit dem Kleben der Kopfplatte, die verwendet werden, um die Maus den Kopf zu stabilisieren, ist bei der Zwei-Photonen-Imaging (Abbildung 1) stören. Identifizieren Sie die Fläche unter einem Binokular verdünnt werden. Vermeiden Sie Bereiche von Interesse direkt über Schädelnähte befinden, wie der Schädel ist weniger stabil in diesen Bereichen und die zugrunde liegenden großen Gefäße und Meningen wird mit bildgebenden stören. </li><li> Wenden Sie 100% Ethanol um 10% Eisenchloridlösung mit einem sterilen Wattestäbchen, um die Membranen auf der Oberseite des Schädels trocken und kratzen sie weg mit feinen Pinzette oder einer Rasierklinge an. Die Nichtbeachtung der Membranen führt zu instabilen Kopfplatte Anlage zu entfernen. </li><li> Legen Sie eine dünne Schicht des Permabond 910 Leim an den Kanten des Sichtfensters unterhalb der Kopfplatte. Legen Sie die Kopfplatte mit Kleber über den Bereich der Zinsen auf das Tier den Schädel mit leichtem Druck (Abbildung 1) beschichtet. Es ist wichtig, dass die Kopfplatte ist nur bis auf die Knochen des Schädels aufgeklebt. Jede Haut oder Membranen, die zwischen der Kopfplatte und der Schädel gefangen verringert die Stabilität der Bindung. Eine kleine Menge von Acrylat um das Sichtfenster mit einer Spritze sofort Bindung der Kleber. Schließlich eine kleine Menge von Loctite 454 auf die Ränder des Sichtfensters, um Leckagen zu verhindern. </li><li> Schrauben Sie die Kopfplatte der Tierhalter (Abbildung 1) und überprüfen Sie die Stabilität der Kopfplatte unter einer Dissektion Umfang durch leichtes Sondieren mit einer Pinzette. Es sollte keine Bewegung des Schädels in Bezug auf die Kopfplatte werden. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf das Sichtfenster, um sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li></ol> 2. Vorbereiten des Verdünnt Schädel Kortikalisfenster <ol><li> In Vorbereitung auf die Ausdünnung des Schädels, trockenen Schädel mit einer Kombination aus sterile Wattestäbchen und Druckluft. Wir haben uns zunächst dünn den Schädel mit einer sterilen IRF 007 Bohrer in einem MicroTorque II Bohrmaschine bei 4000 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Sehr sanft, beginnen Ausdünnen einer 2-2,5 mm Durchmesser Kreisfläche des Schädels. Verwenden Sie nur leichten geschwungenen Bewegungen nahezu parallel zu den Schädel, die Nutzung keinen direkten Druck. Stoppen Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit der Druckluft. Diese Brüche in Bohrungen ermöglichen den Schädel zu kühlen, so gibt es keine Hitze-induzierte Schäden an den darunter liegenden Hirngewebes. <ol class="lalpha"><li> Da die Bohrungen fortschreitet, bemerken den Übergang zu den feuchteren Spongiosa Schicht (dh die &quot;Diploe&quot;). Sobald diese Schicht erreicht ist, die Ausübung besonderer Vorsicht mit dem Bohrer. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie gelegentlich die Schlankheit des Schädels, indem über die ausgedünnt Bereich Kochsalzlösung und Betrachten unter dem Binokular. Saline wird weiter ermöglichen Wärmeableitung. Da der Schädel ist ausgedünnt, wird kleiner Gefäße sichtbar. </li><li> Verwenden Sie eine sterile zahnärztliche MicroBlade zur endgültigen Verdünnung unter Kochsalzlösung zu erreichen, wie die MicroBlade bietet viel mehr taktile Rückmeldung über die Stabilität des Schädels. Dies ermöglicht eine sehr viel dünner als die Vorbereitungen mit dem Bohrer allein. Aus unserer Erfahrung ist die optimale Schädel Dicke 10-30 um. <ol class="lalpha"><li> Es ist wichtig, um die Schlankheit des Schädels unter Epifluoreszenz mehrfach überprüfen während der ersten Versuche, einen dünnen Schädel-Fenster. Die Schärfe und Tiefe sichtbar Mikroglia und Gefäßsystem geben einen guten Hinweis darauf, wenn das Fenster bereit für die Bildgebung ist. </li></ol></li><li> Sobald das Fenster fertig ist, kleben Sie ein maßgeschneidertes rechteckiges Stück # 0 Deckglas wi<html> th eine Dimension von weniger als 2 mm auf jeder Seite über dem Fenster. Mit einem Durchmesser von 1,0 mm Glaspipette, platzieren Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf dem Schädel gelichtet Bereich und vorsichtig weiter unten das kleine Stück Deckglas, dann drücken Sie vorsichtig gegen den Schädel zu verdrängen überschüssige Menge der Leim. Es ist wichtig, um eine Blasenbildung zwischen dem Glas und den Kleber zu vermeiden, da eingeschlossene Luft den Bereich führen wird unter an sich optisch undurchsichtig. Der Sekundenkleber wird verwendet, weil es transparent bleibt, wenn sie trocken und verhindert auch, dass Knochen und Membran Nachwachsen halten den Schädel unter dem Fenster dünn und durchscheinend. Wenn es einen Kleber auf der Oberseite des Deckglases, verwenden Sie die MicroBlade sorgfältig entfernen, sobald das Deckglas in Kraft ist und der Leim trocken ist. </li><li> Ein Schmerzmittel (z. B. Buprenorphin 2 mg / kg subkutan) wird unmittelbar nach der Operation verabreicht und bei Anzeichen von Schmerzen erneut verabreicht, einschließlich Zurückhaltung zu bewegen, essen oder trinken, Gewichtsverlust, Speichelfluss, Piloerektion, Atemgeräusche, usw. </li></ol> 3. Zwei-Photonen-Imaging <ol><li> In Vorbereitung auf die Zwei-Photonen-Imaging, decken die TSCW mit Kochsalzlösung und suchen Sie den Bereich von Interesse unter Epifluoreszenz (Abbildung 2). Für eine nachfolgende Bildgebung der Region, nehmen Sie ein Bild mit einer Fotokamera. </li><li> Für Zwei-Photonen-Imaging, verwenden wir ein maßgeschneidertes Zwei-Photonen-Mikroskop 6 mit einem Ti: Saphir-Lasers abgestimmt, um 920 nm. Die Fluoreszenz wird mit Hilfe eines Photomultipliers in Ganzfeld-Erkennung-Modus und eine 580/180 Emissionsfilter erkannt. A 20X Wasser-Immersions-Objektiv (0,95 NA) ist im gesamten Imaging-Sitzung verwendet werden. Die maximale Leistung der Laserleistung auf das Ziel liegt zwischen 50 und 65 mW eingestellt. </li><li> Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 pm unterhalb der Pia-Oberfläche). Zur Erleichterung der Re-Imaging, machen Sie Fotos von der gleichen Sichtfeld bei 1X, 2X und 3X Digitalzoom. Blutgefäße können als Landmarken dienen, leicht zu finden die gleichen Sichtfeld während der nachfolgenden Abbildung Sitzungen. Unter einem Zoom von 3X, mehrere z-Stapeln mit 80-90 Z-Schritte in jedem Stapel und eine 0,69 &amp;mgr; Schritt können alle 5 Minuten für bis zu 30 Minuten, was eine gute Probenahme von Mikroglia-Morphologie und Verhalten im Laufe der Zeit können erworben werden ( Abbildung 3). Zwischen den Erwerb von Z-Stapel, sollte man überprüfen, das Niveau der Kochsalzlösung über die TSCW sowie des Tieres Narkosetiefe. </li></ol> 4. Die Injektion des HIV-1 Neurotoxin, Tat <ol><li> Zunächst silanisieren die innere Auskleidung einer 35-Gauge-Nadel und 10 ul Mikrovolumen Spritze Tat Ablagerung zu verhindern. Ziehen Sie die Silanisierung Lösung (Sigmacote), bis er sowohl die Nadel und Spritze füllt. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Leeren Sie die Lösung aus der Spritze, entfernen Sie den Kolben, und lassen Sie die Spritze und Nadel vollständig trocknen. Schließlich, waschen Sie die Spritze und Nadel gründlich mit entionisiertem Wasser. </li><li> Führen Sie eine kleine Kraniotomie 0,5 mm im Durchmesser entweder 3 mm rostral oder lateral des TSCW, wo Zwei-Photonen-Bilder erhalten worden sind, mit einem kleineren Bohrer und sorgfältig Ausdünnung des Schädels, bis eine Pinzette mit scharfen Spitzen kann die verdünnte Schicht entfernen Knochen einfach weg. Wir verwenden eine 10 l Mikrovolumen Spritze mit 35-Gauge-Nadel durch eine Ultramicropump III Spritzenpumpe auf einem 3-Achs-Mikromanipulator und nach Futter bis die Nadelspitze auf die Kraniotomie montiert gesteuert ausgestattet, ist es sorgfältig fortgeschrittenen zu einer Tiefe von 700 bis 900 mu m unterhalb die Pia-Oberfläche, wo 3 ul Tat 1-72 (oder andere pro-inflammatorische Wirkstoffe) oder Kochsalzlösung (oder Kontrolle Fahrzeug) bei 80 nL / min geliefert wird. </li></ol> 5. Tierhaltung <ol><li> Wenn das Tier abzubildenden mehrfach an einem einzigen Tag werden, decken die offene Fläche des Schädels mit einer Mischung aus Augensalbe und Vaseline, um Beschwerden oder Schäden an der Schädelbasis zwischen Imaging-Sitzungen zu verhindern. Trennen Sie die Unterstützung Brücke aus dem kleinen Kopf-Platte (siehe Abbildung 1B) und platzieren Sie das Tier in einem Käfig erwärmt mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser. Alle Tiere werden einzeln nach der Operation jederzeit untergebracht werden. Sobald die Bildgebung Sitzungen für ein Tier für einen bestimmten Tag fertig sind, entfernen Sie vorsichtig den gesamten Kopf-Platte und Naht der Haut wieder über den Schädel mit Nr. 6 oder kleiner Naht. Wieder Haus die Tiere einzeln mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser zwischen experimentellen Tagen. Überprüfen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Stress, Schmerzen oder Infektion. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Stabilisierung des Tieres für Chirurgie und Zwei-Photonen-Imaging (A) und Kopf-Bauweise (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Epifluoreszenz. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Zwei-Photonen-Imaging nach der Implantation der TSCW, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die einzelnen Zwei-Photonen-Abschnitten entnommen 15-30 Minuten nach der Implantation der TSCW (Tag 0), sowie 7 und 17 Tage später, zeigen, dass die Fenster klar bleibt, während Mikrogliazellen in Abwesenheit von entzündlichen Beleidigungen bleiben inaktiviert. Die z-Projektionen genommen 6 und 24 Stunden nach der Injektion der HIV Neurotoxin tat weisen beeindruckende morphologische Veränderungen der aktivierten Mikroglia. Maßstab: 10 pm.

<ol>
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Es besteht wachsender Konsens, dass das eigentliche Substrat für die HIV-1 assoziiert neurokognitiven Defizite (HAND) die Vernichtung der synaptischen Architektur, vermutlich von pro-inflammatorischen Mediatoren aus HIV-1 infizierten mononukleären Phagozyten freigesetzt verursacht wird. Mikroglia-Aktivierung, mehrkernige Riesenzellen und Gliose aufgrund astrozytären Hypertrophie gelten als unspezifische Markenzeichen des HIV-1 Infektion und Entzündung im ZNS 7. Im Gegensatz dazu hat die Schwere der premortem neurologische Erkrankung mit Verlust der synaptischen Komplexität sowie Makrophagen Belastung im ZNS 8,9,10,11 korreliert. Allerdings dynamischen Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, periphere infiltrierenden Makrophagen und Neuronen bei Patienten mit HAND kann einfach nicht modelliert mit herkömmlichen statischen Verarbeitung von konventionellen immunzytochemische Studien gewonnen werden. Jüngste Studien aus unseren Labors haben ergeben, dass zumindest einige dieser Wechselwirkungen zwischen peripheren und zentralen mononukleären Zellen und Neuronen in Teil kann durch stereotaktische Injektion des HIV-1-Protein Tat 1-72 werden in Hirnparenchym (Lu, Marker, Tremblay modelliert, Qi und Gelbard, unveröffentlichte Daten). Wir beschlossen daher, in vivo Zwei-Photonen-Imaging gelten für das Zusammenspiel von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen zu untersuchen, in einem kleinen gefügig Tiermodell für NeuroAIDS. Während offenen Schädel oder ausgedünnte Schädel Vorbereitungen leisten einer einzigen Untersuchung der kortikalen Architektur für eine kurze Zeit (Stunden), Ermittler in den zeitlichen Verlauf der subakuten Ereignisse können nicht diese Präparate ohne artifactually Aktivierung Mikroglia / Makrophagen durch chirurgische Manipulation der interessierten die Schädeldecken Fenster. Hier zeigen wir eine einfache Möglichkeit zur Umgehung dieser Beschränkung durch Verkleben ein winziges Stück Deckglas über dem Schädel gelichtet Bereich verhindert das Schädeldach aus nachwachsenden in der TSCW sowie die Aufrechterhaltung Transluzenz für ≥ 3 Wochen. Wir zeigen ferner, dass uns diese Technik, um das Verhalten der peripheren Monozyten Eingabe zerebralen Mikrovaskulatur sowie Gehirn-Wohnsitz Mikroglia in Reaktion auf die stereotaktische Injektion von HIV-Tat 1-72 im Kortex von Mäusen, die heterozygot für CX 3 CR 1 / GFP überwachen kann ( zu identifizieren Zellen der mononukleären Linie). Diese Technik kann leicht angepasst, um auf Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen verwenden, zum Beispiel verwenden wir routinemäßig heterozygot CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 Mäusen zu Wechselwirkungen zwischen Monozyten-Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen in Untersuchung in vivo Modelle Neuroinflammation relevanten HAND. Unsere TSCW Vorbereitung ermöglicht Ermittler Zell-Zell-Interaktionen zwischen Peripherie und ZNS, die über Zeiträume von Wochen, in denen das Tier immer wieder vor und nach der experimentellen Behandlung abgebildet werden können auftreten zu studieren. So kann jedes Tier als seine eigene Kontrolle dienen. Eine Einschränkung für diese TSCW Modells ist, dass die Zielzellen untersucht werden entweder gentechnisch verändert, um verbesserte fluoreszierende Proteine ​​(eXFP) ausdrückliche oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff ohne mechanische Verletzung der Schädelkalotte gekennzeichnet werden müssen, und dass eXFP Ausdruck muss robust genug sein, um ermöglichen zellulären Architektur zu werden, nachdem wiederholt Imaging-Sitzungen über einen Zeitraum von Wochen visualisiert.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

Traditionell in den Neurowissenschaften, in vivo Zwei-Photonen-Imaging des murinen zentrale Nervensystem hat entweder den Einsatz von Open-Schädel 1,2 oder ausgedünnte Schädel 3 Vorbereitungen beteiligt. Während die Open-Schädel-Technik ist sehr vielseitig, es ist nicht für das Studium Mikroglia optimal, weil sie invasiv ist und Mikroglia-Aktivierung verursachen. Auch wenn die ausgedünnten Schädel Ansatz ist minimal-invasiv, das wiederholte erneut Ausdünnung des Schädels für chronische Bildgebung erforderlich erhöht das Risiko von Gewebeschäden und Mikroglia-Aktivierung und ermöglicht eine begrenzte Anzahl von Imaging-Sitzungen. Hier präsentieren wir eine chronische Dünn-Schädel-Fenster-Methode für die Überwachung murine Mikroglia in vivo über einen längeren Zeitraum hinweg mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie man eine stabile, leicht zugängliche, ausgedünnte Schädel kortikale Fenster (TSCW) mit einem apposed Deckglas, dass transluzente im Laufe der drei Wochen intermittierende Beobachtung bleibt vorzubereiten. Diese TSCW Vorbereitung ist weit mehr immunologisch inert gegenüber Mikroglia-Aktivierung als offene Kraniotomie oder wiederholte Schädel Durchforstung und ermöglicht eine beliebige Anzahl von Imaging-Sitzungen während eines Zeitraums von Wochen. Wir bereiten TSCW in CX 3 CR 1 GFP / + Mäusen 4 bis Mikroglia mit Enhanced Green Fluorescent Protein auf ≤ 150 mu m unterhalb der Pia Oberfläche sichtbar zu machen. Wir zeigen auch, dass dieses Präparat in Verbindung mit stereotaktischen Hirn-Injektionen des HIV-1 neurotoxischen Protein Tat, neben dem TSCW, die zu induzieren vermag haltbare microgliosis ist, kann verwendet werden. Daher ist diese Methode sehr nützlich für die Prüfung Änderungen in Mikroglia-Morphologie und Motilität im Laufe der Zeit im lebenden Gehirn in Modelle der HIV-assoziierten neurokognitiven Disorder (HAND) und andere neurodegenerative Erkrankungen mit einem neuroinflammatorische Komponente.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden Monozyten<em&gt; In vivo</em&gt; Über Stunden, Tage oder Wochen mit der transkraniellen Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie zu einem ausgedünnten-Schädel-Fenster, dass eine intermittierende Beobachtung der ruhenden Mikrogliazellen, die durch benachbarte stereotaktische Injektion der HIV-1 regulatorischen Proteins Tat aktiviert werden können, ermöglicht vorzubereiten.

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K Aufrufe.  University of Rochester. Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden Monozyten In vivo Über Stunden, Tage oder Wochen mit der transkraniellen Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie zu einem ausgedünnten-Schädel-Fenster, dass eine intermittierende Beobachtung der ruhenden Mikrogliazellen, die durch benachbarte stereotaktische Injektion der HIV-1 regulatorischen Proteins Tat aktiviert werden können, ermöglicht vorzubereiten...

Serie: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...