Diese Methodik ist insofern von Bedeutung, als sie eine reproduzierbare und genaue Methode zur Quantifizierung topisch angewendeter Arzneimittel unter Verwendung einer kohärenten Raman-Bildgebung ermöglicht. Andere Methoden liefern sperrige kutane pharmakokinetische Informationen, während diese Methodik sowohl groß- als auch mikroskalige kutane pharmakokinetische Informationen wie den Permeationsweg eines Arzneimittels liefern kann. Die Visualisierungs-, Quantifizierungs- und Permeationswege ermöglichen die Entwicklung von Arzneimitteln mit einem bestimmten Weg, um den Zielort zu erreichen.
Die Gewebepräparation wird sich als der schwierigste Teil dieser Methodik erweisen. Das Gewebe sollte ausreichend dünn sein, damit man die Haut durchlesen kann. Um mit der Vorbereitung eines nackten Mausohrhautgewebes zu beginnen, erwerben Sie eingeschläferte Nacktmäuse und entfernen Sie die Ohren der Maus mit einer Pinzette und einer mikrochirurgischen Schere.
Legen Sie dann ein Ohr in eine große Petrischale der Größe 60 Millimeter mal 15 Millimeter. Als nächstes spülen Sie das Mausohr zweimal mit PBS aus und tupfen Sie das Ohr jedes Mal mit dem Aufgabenwischer trocken. Wenn es innerhalb von 24 Stunden verwendet wird, legen Sie das Ohr in PBS in eine kleine, 35 Millimeter mal 10 Millimeter große Petrischale bei zwei bis acht Grad Celsius.
Um nach 24 Stunden Ernte zu verwenden, legen Sie das Ohr in eine Petrischale ohne PBS und bedecken Sie die Schale dann mit Parafilm, um sie in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Während Sie unter der biologischen Haube arbeiten, legen Sie das menschliche Hautgewebe in eine große Petrischale mit der Stratum corneum-Seite nach unten, so dass das subkutane Fett zugänglich ist. Verwenden Sie dann eine Pinzette und eine mikrochirurgische Schere, um das subkutane Fett zu entfernen.
Sobald das Unterhautfett nicht mehr mit der Schere entfernt werden kann, verwenden Sie ein Einwegskalpell mit 10 Klingen in einem Winkel von 45 Grad zur Haut, um das verbleibende subkutane Fett zu entfernen, während Sie die Haut mit einer Pinzette ruhig halten. Wenn das Fett entfernt ist, schneiden Sie die menschliche Haut in einen Zentimeter mal einen Zentimeter Stücke. Für die Lipidbildgebung platzieren Sie den vorderen Teil des Mausohrs in Richtung des Glasbodens einer 35-Millimeter-Schale mit der Nummer Null.
Für die menschliche Haut legen Sie die Haut mit dem Stratum corneum nach unten, um eine Arzneimittelquantifizierung von den oberflächlichen bis zu den tieferen Schichten zu ermöglichen. Sobald das Gewebe auf dem Glasboden zentriert wurde, verwenden Sie einen Baumwollspitzenapplikator, um sicherzustellen, dass die Haut flach ist und vollständigen Kontakt mit der Deckrutschfläche der Glasbodenschale hat. Um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern, legen Sie eine Unterlegscheibe auf die Haut und stellen Sie sicher, dass das Gewebe durch das mittlere Loch der Unterlegscheibe sichtbar ist, um eine stimulierte Raman-Streuung oder SRS-Transmissionserkennung zu ermöglichen.
Die vorbestimmte Dosis der Formulierung auf die Haut pipettieren und dann mit einem behandschuhten Finger im Uhrzeigersinn 30 Sekunden lang reiben. Nachdem die vorgegebene Zeit für die Durchdringung der Formulierung abgelaufen ist, entfernen Sie die überschüssige Formulierung, bevor Sie die Haut mit der Formulierungsseite in Richtung der Glasbodenschale legen. Fahren Sie als Nächstes mit dem Versuchsaufbau fort, indem Sie die Microscope Control- oder MC-Software einschalten.
Wenn Sie durch das Okular schauen, stellen Sie den axialen Fokus mit dem Einstellknopf ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe im Fokus ist. Wenn Sie fertig sind, entsperren Sie sowohl die Pumpe als auch die Stokes-Strahlen und vergewissern Sie sich, dass die ALG1- und ALG2-Kanäle aktiviert sind. Stellen Sie sicher, dass sich die SRS-Fotodiode über dem Kondensator befindet, und klicken Sie dann in der MC-Software auf Focus x2, um die Haut in den CARS- und SRS-Kanälen zu visualisieren.
Gehen Sie im Modul Multi-Area Time Lapse oder MATL zur Registerkarte Ansicht und klicken Sie auf die Liste der registrierten Punkte, damit die Bildliste angezeigt wird. Sobald das Stratum corneum identifiziert ist, scrollen Sie durch den axialen Fokus oder Z-Fokus, um spezifische Gewebeschichtungen zu identifizieren. Spezifische Tiefen können in der Haut hinzugefügt werden, wie Stratum corneum, Talgdrüsen, Adipozyten oder subkutanes Fett, wie während der Live-Bildgebung mit lipidabgestimmtem Kontrast bestimmt.
Wenn jedoch ganze Tiefenstapel eingenommen werden sollen, können XY-Positionen hinzugefügt und die relative Z-Position ignoriert werden. Wenn es sich um eine spezifische Bildgebungstiefe für jede Hautschichtung handelt, wählen Sie den Registerpunkt aus, um ihn der MATL-Warteschlange hinzuzufügen. Klicken Sie bei Stapeln mit voller Tiefe im Fenster Erfassungsparameter auf Punkt für jede XY-Position mit Tiefenauswahl registrieren.
Stellen Sie als Nächstes die Anzahl der Wiederholungen im MATL-Modul auf eins ein und klicken Sie auf Bereit. Wenn der Wiedergabepfeil von grau zu schwarz wechselt, drücken Sie die Wiedergabetaste, um mit der Abbildung des vorläufigen Lipidstapels zu beginnen. Sobald der Bildgebungszyklus abgeschlossen ist, blockieren Sie sowohl die Pumpe als auch die Stokes-Strahlen und ändern Sie die Wellenlänge auf der grafischen Benutzeroberfläche des Lasers auf die gewünschte Wellenlänge, basierend auf der angestrebten Wellenzahl oder Raman-Vibration.
Passen Sie die manuelle Zeitverzögerungsstufe an und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die gleichen Kräfte verwendet werden, um das Lipid und den pharmazeutischen Wirkstoff oder API abzubilden, die a priori festgelegt wurden. Sobald die Gesamtzahl der Zykluswiederholungen ausgewählt wurde, entsperren Sie den Pumpenstrahl und überprüfen Sie, ob die Leistung mit der Fotodiode der gewünschten Leistung entspricht, bevor Sie Play drücken, um mit der automatisierten Abbildung der Sollwerte zu beginnen. Führen Sie als Nächstes eine Datenanalyse für jede Hautschichtung durch, indem Sie ein Talgdrüsenlipidbild nach Fidschi importieren und das Kontrollkästchen Split-Kanäle aktivieren, um die Datei in die CARS- und SRS-Kanäle aufzuteilen.
Um die Region of Interest oder den ROI Manager zu öffnen, klicken Sie auf Analyse, Tools und ROI Manager. Wenn Sie den SRS-Kanal so verwenden, dass C gleich eins ist, entfernen Sie die Talgdrüse im Bild und fügen Sie die Markierungen dem ROI-Manager hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf T hinzufügen klicken. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Talgdrüse im Bild.
Um die lipidreichen Regionen auszublenden, wählen Sie jeden ROI aus und klicken Sie dann auf die Registerkarten Mehr, ODER Kombinieren und Hinzufügen. Um die lipidarmen Regionen auszublenden, verwenden Sie das Rechteckwerkzeug im Fidschi-Menü und zeichnen Sie ein Quadrat um das gesamte Bild. Fügen Sie die Region dem ROI-Manager hinzu.
Klicken Sie auf den neu hinzugefügten quadratischen ROI zusätzlich zum ROI, der alle lipidreichen Regionen im ROI-Manager auswählt. Wählen Sie unter Mehr die Option XOR aus, um eine Maske der lipidarmen Regionen zu generieren und sie dem ROI-Manager hinzuzufügen. Verketten Sie die Bilder in numerischer Reihenfolge, indem Sie zu Bild, Stapel, Tools und verketten Sie die Registerkarten in der richtigen Reihenfolge aufrufen.
Alternativ können Sie die Bilder importieren, indem Sie eines in Fidschi laden und dann auf der Setup-Seite eine Option namens Gruppendateien mit ähnlichen Namen auswählen. Während das verkettete Bild aktiv ist, gehen Sie zum ROI-Manager, um die lipidreichen Regionen auszuwählen, und klicken Sie auf die Registerkarte Mehr, bevor Sie Multi Measure auswählen, und warten Sie, bis das Ergebnisfenster angezeigt wird. Exportieren Sie die Daten im Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle und fügen Sie eine Spalte mit dem Titel Region hinzu, um jeder Datenzeile lipidreiche Bereiche hinzuzufügen.
Fügen Sie lipidarm zu Regionen hinzu, die außerhalb der Lipide lagen. Um die Daten zu visualisieren, speichern und importieren Sie die Tabelle in das R-Paket ggplot2. Zeichnen Sie dann die Daten als Funktion der Bildzahl im Vergleich zur mittleren Intensität, um die Konzentrations-Zeit-Daten zu schätzen.
Führen Sie eine nicht-kompartimentelle Analyse oder NCA in RStudio für die aus der Tabelle importierten Intensitätszeitdaten mit dem Aufruf für eine Ebene aus. Wenn Sie fertig sind, zeichnen und vergleichen Sie Jmax und AUCflux - alle Metriken. Führen Sie zusätzlich statistische Vergleiche über experimentelle Bedingungen durch.
Die repräsentative Analyse zeigt Stratum corneum, Talgdrüsen, Adipozyten, subkutanes Fett aus der nackten Mausohrhaut und Stratum corneum, papilläre Dermis und eine Talgdrüse aus der menschlichen Haut. In nackter Mausohrhaut wurde die begrenzte Gewebebewegung der Talgdrüsen mit der gleichen Gewebetiefe der Drüsen zum Zeitpunkt der Formulierungsanwendung und 120 Minuten nach der Anwendung beobachtet. Die erhebliche Gewebebewegung in der Haut zeigte nach 120 Minuten Medikamentenanwendung kaum sichtbare Talgdrüsen, was die Ineffizienz des ursprünglichen Protokolls zeigt.
In mehreren Studien zeigten die Intensitäts- und Zeitprofile hohe Anfangskonzentrationen, gefolgt von abnehmenden Konzentrationen, was auf keine weitere Absorption des Arzneimittels in das Gewebe hindeutet. Auf der anderen Seite deuteten einige Studien auf einen Anstieg der Intensitäten hin, die später über die experimentelle Dauer abnahmen, was zeigte, dass der Fluss in das Gewebe vor der Bildgebung kein Maximum erreicht hatte. Die NCA-Analyse von Konzentrations-Zeit-Profilen von zwei Formulierungen für denselben Wirkstoff ergab, dass das Ethoxy-Ethoxyethanol unabhängig von der Hautschicht eine verlängerte API-Permeation im Vergleich zu der der Gelformulierung lieferte.
Die Gesamtexpositionsanalyse zwischen den gleichen Formulierungen zeigte ähnliche Beobachtungen in den tieferen Hautschichten. Die Vorbereitung der menschlichen Haut und die richtige Platzierung der Haut auf der Glasbodenschale nach der Arzneimittelanwendung sind entscheidend für den Erfolg des Experiments. Die klaren Lösungen hier zeigten die Eignung dieser Methodik.
Weitere Forschungen werden vermarktete Formulierungen wie Cremes umfassen, um zu verstehen, wie sich die Formulierung auf die API-Penetration und -Permeation auswirkt.
