Diese Methode erleichtert die effiziente intrathekale Abgabe von adenoassoziierten viralen Transgenen bei wachen Kleintieren für die experimentelle Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie ALS. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass die virale Lösung 1%Lidocainhydrochlorid enthält, das nach einer erfolgreichen Injektion eine vorübergehende Lähmung induziert. Obwohl diese Methode einen visuellen Indikator für die Beurteilung des Erfolgs der intrathekalen automatisierten Situation bietet, ist eine ausreichende Praxis unerlässlich, um die Erfolgsrate der Lieferung zu verbessern.
Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, befestigen Sie eine 27-Spur-Nadel an einer 25-Mikroliter-Hamilton-Spritze und richten Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der Volumetskala auf der Spritze aus. Dann 8 Mikroliter von 4 x 10 vorsichtig in die 10. Genomkopien der Viruslösung in die Spritze laden, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Als nächstes legen Sie eine wache 30 bis 70 Tage alte 12 bis 30 Gramm Maus auf ein Bettstück in der anfälligen Position in einer Biosicherheitshaube und bedecken Sie den Oberkörper mit steriler Gaze, um die Maus zu beruhigen und zu vermeiden, gebissen zu werden.
Greifen Sie die Maus fest auf ihren Beckengürtel mit dem Daumen auf der einen Seite und dem Zeigefinger und Mittelfinger auf der anderen Seite, die die Haut zwischen den bilateralen Beckengürteln mit Daumen und Zeigefinger straff halten. Dann rasieren Sie das Fell zwischen den bilateralen Beckengürteln und sterilisieren Sie die exponierte Haut mit einem Jod-basierten Peeling und 70%Ethanol. Zur direkten intrathekalen Abgabe der adenoassoziierten Viruslösung, palpatieren Sie den Intervertebralen Raum entlang der Mittellinie zwischen den bilateralen Beckengürteln und verwenden Sie einen Fingernagel, um eine Einbuchtung in die Haut zu drücken, um den Bandwirbelraum L5 bis L6 anzuzeigen.
Drehen Sie die Basis des Schwanzes leicht und sanft, um die Mittellinie der Wirbelsäule zu offenbaren und passen Sie die Nadelnadel in Richtung des Kopfes des Tieres an. Wenn die Maus fest in Position fixiert ist, richten Sie die Nadel entlang der Mittellinie der Wirbelsäule aus und legen Sie die Nadel sanft und vertikal in die Mitte des Einzugs ein, wobei die Spritze in einer zentralen sagittalen Ebene gehalten wird. Wenn die Nadel mit dem Knochen in Berührung kommt, verringern Sie langsam den Winkel auf etwa 30 Grad und schieben Sie die Nadel in den Intervertebralraum.
Ein plötzlicher Schwanzstreifen ist ein Zeichen für einen erfolgreichen Einstieg in den intraduralen Raum. Wenn die Nadel in den Intervertebralen Raum eintritt, fühlt sich die Spitze fest geklemmt. Injizieren Sie die Vektorlösung, und halten Sie die Nadel innerhalb des intraduralen Raumes für eine Minute.
Ziehen Sie dann langsam die Nadel mit Rotation ab, um Leckagen zu minimieren. Bewerten Sie sofort die vorübergehende Schwäche der Mausgliedmaßen, um die Injektionsqualität zu bewerten und die Maus in ihren Käfig zurück, um sich von der Lähmung zu erholen. Fixieren Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Gliedmaßen und den Kopf der injizierten Maus in der anfälligen Position auf einer Schaumstoffbox-Abdeckung und verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Kopf bis zum Kreuzbein zu entfernen.
Clip den Schädel zwischen den Augen, schnitt entlang der Mittellinie des Schädels und die horizontale Linie über dem Kleinhirn und öffnen Sie den Schädel auf jeder Seite. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Okzipitalknochen zu entfernen und verwenden Sie eine Augenschere, um den Spinalkanal bilateral zu öffnen. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten und entfernen Sie vorsichtig den oberen Teil der Wirbel.
Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um das Gehirn zu heben und die Nerven der Schädelbasis zu trennen. Dann das gesamte Gehirn und Rückenmark sorgfältig extrahieren und das Gewebe in 4%Paraformaldehyd für 24 Stunden fixieren. Am Ende der Fixierungsphase, kryoprotect das Gehirn und Zervix und Lendenrückenmark in 30%Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 Grad Celsius gefolgt von einbetten in optimale Schneidtemperatur Verbindung vor dem Einfrieren des Spülens in flüssigen Stickstoff.
Verwenden Sie dann einen Kryostat, um 25 Mikrometer dicke Abschnitte von jedem Gewebe zu erhalten, speichern Sie die gefrorenen Abschnitte in 0,01 Molar PBS bei 4 Grad Celsius, wie sie erhalten werden. Für die immunhistochemische Analyse des Gewebes, die frei schwebenden Abschnitte mit 1%Wasserstoffperoxid für 10 Minuten, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in PBS. Als nächstes inkubieren die Proben in einer Blockierlösung, die 5%Serum und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS für 1 Stunde enthält, gefolgt von einer Nachtetikettierung bei 4 Grad Celsius mit den entsprechenden primären Antikörpern von Interesse.
Am nächsten Tag die Abschnitte mit 3 10 Minuten Wäscht in PBS plus Tween waschen und die Dias mit den entsprechenden biotinylierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur 1 Stunde nach der letzten Wäsche bebrüten. Am Ende der Inkubation die Abschnitte 3 Mal in frischem PBST waschen, wie gerade gezeigt, und die Proben mit unendlichem Biotinperoxidase-Komplex für 40 Minuten inkubieren, gefolgt von der Färbung mit einem geeigneten chromogenen Mittel. Montieren Sie die beschrifteten Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias und tränken Sie die Dias 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol, sobald die montierten Abschnitte vollständig getrocknet sind.
Als nächstes die Dias in Xylol für 10 Minuten einweichen und mit einem geeigneten Montagemedium versiegeln. Dann stellen Sie die Dias mit einem Lichtmikroskop mit einem ladungsgekoppelten Gerät bei 100- und 400-fachen Vergrößerungen vor. Die eGFP-Immunostainierung von Hals- und Lendenrückengewebeabschnitten zeigt wenig oder gar keine Transduktion im Lendenrücken von Mäusen mit einem Schwächenwert von 0, leicht verbesserte Transduktion bei Mäusen mit einem Schwächenwert von 1 und starke und weit verbreitete Transduktionen bei Mäusen mit einem Schwächenwert von 4 oder 5.
Die Quantifizierung der GFP-Färbungsintensität von Rückenmarksgewebeabschnitten von Mäusen, die verschiedene Grade der vorübergehenden Gliedmaßenschwäche aufweisen, deutet darauf hin, dass die Schwere der Schwäche nach der Injektion der Viruslösung eng mit dem Ausmaß der Rückenmarkstransduktion korreliert. Im Gehirn werden robuste eGFP-Signale in der Olfaktor-Lampe, dorsolateralen präfrontalen Kortex, Dentate Gyrus und der CA3-Zone des Hippocampus, kleinhirnskaxischen Kortex und Randbereichen des Hirnstamms, einschließlich des Gesichtskerns, des Aderhautplexus und der ependymalen Epithelzellen, detektiert. Motorneuronen in den vorderen Hörnern werden auch stark in verschiedenen Ebenen des Rückenmarks transduziert.
Darüber hinaus werden im Kortex GFP-positive Neuronen einschließlich Pyramidenzellen sowie verschiedene Gliazelltypen wie Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten nachgewiesen. Diese Technik ermöglicht es Forschern im Bereich der Neurologie, die therapeutischen Wirkungen der direkten intrathekalen Entbindung bei kleinen wachen Tieren auf Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu erforschen.
