Konvektionsverbesserte Abgabe(CED) von optogenetischen Virusvektoren bei nichtmenschlichen Primaten wird es Forschern ermöglichen, neuronale Aktivität in großem Maßstab zu manipulieren, um komplexe neuronale Berechnungen und Verhaltensweisen zu verstehen. Mit CED können wir eine hohe optogenetische Expression über große Regionen des Primatenhirns mit nur wenigen Injektionen in kurzer Zeit im Vergleich zu traditionellen Methoden erreichen. Magnetresonanz oder MR-kompatible Kammerimplantation wird in DerRegel bei nichtmenschlichen Primatenoperationen durchgeführt, das Verfahren wird im Textprotokoll ausführlich beschrieben und in diesem Video kurz beschrieben.
Nach der Sedierung, Positionierung und anfänglichen Einschnitte, wie im Textprotokoll beschrieben, erstellen Sie eine kreisförmige Kraniotomie, um die vorgeplanten Flugbahnen für Injektionen mit einem Trephin abzudecken. Erstellen Sie einen Einzug in der Mitte der geplanten Kraniotomie ausreichend tief im Schädel, um das Trephin mit dem einstellbaren Mittelpunkt des Trephins zu verankern. Sobald die Mitte gemacht ist, senken Sie das Trephin auf den Schädel und drehen Sie das Trephin im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie Abwärtsdruck ausüben, bis die Knochenkappe mit Zangen entfernt werden kann.
Nach dem Anheben der Dura, wie im Textprotokoll beschrieben, schneiden Sie die Dura von der Mitte bis zum Rand der Kraniotomie und fahren Sie entlang der Kante mit feiner ophthalmologischer Schere fort. Montieren Sie die zylindrische maßgeschneiderte Konvektion verbesserte Lieferung MR-kompatible Kammer auf den Schädel auf der Oberseite der Kraniotomie, um Kanülenunterstützung während der Infusion zu bieten, so dass die Krümmung des Kammerflanschguts gut mit der Krümmung des Schädels ausgerichtet ist. Befestigen Sie die Implantate am Schädel entweder mit Kunststoffschrauben und Dental-Acryl oder ein paar Titanschrauben.
Befüllen Sie das Gitter kurz nach dem Implantieren der MR-kompatiblen Kammer und dem Einsetzen des Kanüleninjektionsgitters mit 0,9% Saline zur Visualisierung der Injektionsstellen über MR-anatomische Bilder. Füllen Sie auch die Kammerhohlräume mit nasssterilem, resorbierbarem Gelschaum, um die Feuchtigkeit des Gehirns aufrechtzuerhalten. Bedecken Sie die Haut und den Zylinder mit einem sterilen antimikrobiellen Schneidvorschnitt, um die Sterilität der Zylinder während des Transports und MR-Infusionen aufrechtzuerhalten.
Legen Sie eine Vitamin-E-Kapsel, um die Oberseite des Injektionsgitters für eine positive Identifizierung zu markieren. Während das Tier intubiert bleibt, lösen Sie das Endotrachealrohr aus dem Anästhesiekreislauf und befestigen Sie es wieder an einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluran-Maschine. Transportieren Sie das Tier zum MRT-Scanner.
Erfassen Sie T1-Bilder, um den Abstand vom oberen Rand des Injektionsgitters und der kortikalen Oberfläche zu berechnen. Die Vitamin-E-Kapsel ist in T1-Bildern deutlich sichtbar und sollte als Marker für die Oberseite des Injektionsgitters verwendet werden. Erfassen Sie T2-Bilder, um die optimalen Kanülenführungen für jeden Standort basierend auf dem Zielort der Infusion zu bestimmen.
Das Kanülenraster ist mit Einer Saline gefüllt, die in T2-Bildern am besten sichtbar ist. Mit der MR-Bildgebungssoftware scrollen Sie durch die koronalen und sagittalen Ebenen, um den Zielort der Infusion zu finden. Nachdem Sie den viralen Vektor für ein paar Stunden bei Raumtemperatur auftauen, mischen Sie den viralen Vektor mit dem MR-Kontrastmittel Gadoteridol durch Pipetten- oder Wirbelmischung.
Laden Sie das gemischte Virus in 0,2 Milliliter Hochdruck-IV-Schläuche. Mit Hochdruck-IV-Schläuchen eine lange Verlängerungsleitung an eine MR-kompatible Drei-Milliliter-Spritze anschließen und mit Kochsaline grundieren. Schließen Sie das andere Ende des langen Verlängerungsschlauchs an die 0,2 Milliliter IV-Schläuche an, die mit dem Virus beladen sind.
Dann befestigen Sie die refluxbeständige Kanüle mit einer ein Milliliter gestuften Spitze mit einem Klemmen-Katheterstecker am distalen Ende dieser Baugruppe. Stellen Sie die Spritze schließlich in eine MR-kompatible Pumpe ein. Wählen Sie anhand der erhaltenen anatomischen MR-Basisbilder die Position des Kanüleninjektionsgitters und die Einfügetiefe aus, die erforderlich sind, um die Zielinfusionsstelle zu erreichen.
Markieren Sie die Einfügetiefe auf der Kanüle mit sterilem Klebeband. Beginnen Sie die Infusion mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute und validieren Sie den Fluss der Flüssigkeit in der Infusionslinie visuell, indem Sie den Auswurf von Flüssigkeit aus der Kanülenspitze beobachten. Legen Sie die Kanüle manuell durch das Injektionsgitter in die Zieltiefe ein und halten Sie gleichzeitig den Durchfluss in der Infusionslinie aufrecht, da dies verhindert, dass das eingedrungene Gewebe die Kanüle während des Einsetzens verstopft.
Erfassen Sie jetzt schnelle Flash-T1-gewichtete Bilder für die Online-Überwachung der viralen Vektorinfusion. Nach der Infundierung von ca. 10 Mikroliter des Vektors, so dass genügend Viren in den MR-Scanner infundiert werden, erhalten Sie MR-Bilder, um die korrekte Kanülenplatzierung zu überprüfen, wie die stagnierte Ausbreitung des Virus zeigt. Wenn die Tiefe der eingelegten Kanüle falsch ist, passen Sie die Tiefe entsprechend an oder entfernen Sie langsam die Kanüle, und versuchen Sie erneut, die Einfügung zu versuchen.
Überwachen Sie die Infusion durch Anleitung von Online-MR-Bildern. Erhöhen Sie die Infusionsrate auf fünf Mikroliter pro Minute um einen Mikroliter pro Minute Schritte alle paar Minuten. Es ist wichtig, die Infusionsrate langsam zu erhöhen und nicht mehr als fünf Mikroliter pro Minute zu überschreiten, da hohe Infusionsraten Gewebeschäden verursachen könnten.
Nachdem Sie etwa 40 Mikroliter des viralen Vektors infundiert haben, beginnen Sie, die Infusionsrate um einen Mikroliter pro Minute zu reduzieren. Beenden Sie die Infusion, nachdem ca. 50 Mikroliter injiziert wurden. Lassen Sie die Kanüle für zehn Minuten an Ort und Stelle.
Entfernen Sie langsam die Kanüle aus dem Gehirn und bewegen Sie sich zum nächsten Ort. Den Zylinder vor dem Tiertransport mit einem sterilen Vorhang am Ende der Injektionen bedecken und das Tier dann zurück in den Operationssaal transportieren. Histologische Analysen an seriellen koronalen Abschnitten zeigen eine großangelegte optogenetische Expression um die Infusionsstellen.
Hier sind das koronale Basisbild und die Ausbreitung des Kontrastmittels nach der Infusion für dieselbe MR-Koronascheibe zu sehen. Ein koronaler Gewebeabschnitt wird ungefähr gleich dargestellt. Peroxidase-Färbung spiegelt die Expression des gelben fluoreszierenden Proteins oder EYFP-Reporters wider.
Eine gute Ausrichtung wird zwischen dem Bereich der EYFP-Expression beobachtet, gemessen mit Oberflächenepifluoreszense und mit histologischer Färbung. Dazu gehört die Region der Vektorausbreitung, die aus MR-Bildern geschätzt wird. Weiße Punkte zeigen Injektionsstellen an und der gesamte schwarze Bereich stellt den Bereich dar, der durch die Craniotomie exponiert wird.
Hier ist ein Bild mit geringer Vergrößerung der koronalen Abschnitte zu sehen, die mit einem GfP-Antikörper mit Anti-GFP-Antikörpern befleckt sind und den medialen lateralen Aspekt der YFP-Expression im somatosensorischen Kortex zeigen. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die Position der Kanülenspur an. Das benachbarte Gewebe wird bei größerer Vergrößerung gezeigt, um eine laminare Verteilung der YFP-positiven Zellen zu zeigen.
Dicht besiedelte Regionen von YFP-positiven Zellen befinden sich überwiegend in den Schichten zwei bis drei und fünf bis sechs. Eine weitere Vergrößerung zeigt typische Pyramidenzellen in den Schichten zwei bis drei, Schicht fünf und Schicht sechs. Es ist wichtig, die Kanüle für 10 Minuten an Ort und Stelle zu lassen, nachdem der Fluss gestoppt wurde.
Dadurch wird sichergestellt, dass das Virus in das umgebende zielgerichtete Neuronalgewebe gelangt ist. CED ist ein effizienter Ansatz, um gleichmäßig hohe Expressionsniveaus in großen Hirnregionen bei Säugetieren zu erreichen. Es hat das Potenzial, unser Verständnis von neuronalen Schaltkreisen und Konnektivität zu erweitern.
Nach viraler Transduktion durch CED können nachfolgende optogenetische Stimulationsexperimente mit elektrischen Aufzeichnungs- und Verhaltens-Essays gepaart werden, um die komplexe Schaltungsdynamik im Gehirn zu enthüllen. Diese Technik wurde bereits 2018 von Yazdan-Shahmorad und Kollegen eingesetzt, bei der die optogenetische neuronale Modulation eingesetzt wurde, um netzwerkweite Konnektivitätsänderungen im sensorischen motorischen Kortex zu induzieren.
