Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Verbindungen aus Mollusken mit Anti-Kryptokokken-Eigenschaften. Diese Technik bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur Identifizierung und Isolierung von Verbindungen aus Mollusken mit potenziellen Eigenschaften, einschließlich der Abtötung der menschlichen Pilzpathogene. Es gibt andere Verbindungen, wie HIV-Proteasehemmer, die zur Behandlung von HIV-Patienten verwendet werden.
Die Ausweitung auf andere Krankheitserreger sowie die Erforschung natürlicher Quellen stellen jedoch neue Entdeckungswege dar. Der letzte Schritt ist der schwierigste Schritt, da die Proben möglicherweise nicht gefiltert werden. Infolgedessen müssen die Proben möglicherweise zum Filtern verdünnt werden.
Beginnen Sie mit dem Sammeln von Mollusken wie Cipangopaludina chinensis aus einem ausgewiesenen und zugelassenen Naturgebiet. Wählen Sie einheimische und invasive Arten aus, um ein breites Spektrum potenzieller antimykotischer Wirkungen zu bewerten. Brechen Sie die Schale der C.chinensis vorsichtig mit einem Stößel und Mörser auf und entfernen Sie die festen Stücke mit einer Pinzette.
Im Allgemeinen werden 10 Mollusken für das Protokoll gepoolt. Sammeln und wiegen Sie ungefähr 15 bis 20 Gramm der Probe und schneiden Sie die Organe mit einer Schere in kleine Stücke von etwa 0,5 bis einem Zentimeter Größe. Gefrieren Sie die präparierten und geschnittenen Organproben mit flüssigem Stickstoff, bevor Sie die Organproben mit einem Stößel und Mörser zu einem feinen Pulver mahlen.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie etwa 15 Gramm des Organprobenpulvers in 30 Milliliter kaltes destilliertes Wasser, um ein Verhältnis von eins zu zwei zu erreichen. Gießen Sie zwei Milliliter der Probe in schlagfeste Zwei-Milliliter-Röhrchen und geben Sie etwa 500 Mikrogramm drei Millimeter Edelstahlkügelchen in jedes Röhrchen. Drei Minuten bei 1.200 U/min bei vier Grad Celsius mit einem Kugelmixer oder Perlenbesender homogenisieren.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie den Überstand mit einer 0,22-Mikrometer-Membran und lagern Sie die Proben auf Eis, bevor Sie den Extrakt klären.
Legen Sie die überstehende Probe für 30 Minuten in ein Thermalbad bei 60 Grad Celsius und kühlen Sie sie sofort ab, indem Sie die Probe für 20 Minuten in einen mit Eis gefüllten Eimer geben. Zentrifugieren Sie die kalten Proben bei 15.000 G für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
Filtern Sie die Proben mit einem 0,22-Mikron-Membranfilter und lagern Sie sie dann auf Eis. Wenn Sie fertig sind, bestimmen Sie die Proteinkonzentration im Rohmaterial und in den geklärten Extrakten mit einem Quantifizierungsassay. Der optimale Proteinkonzentrationsbereich liegt bei vier bis acht Mikrogramm pro Milliliter.
Inkubieren Sie die Proben bis zu einer Stunde auf Eis oder gefrieren Sie sie in flüssigem Stickstoff, bevor Sie sie bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius lagern. In einer flachen 96-Well-Bodenplatte werden 10 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter rohem oder geklärtem Molluskenproteinextrakt, 10 Mikroliter Subtilisin A mit einer Konzentration innerhalb des gemessenen linearen Bereichs und 220 Mikroliter 100 millimolaren Trishydrochlorids von 8,6 pH für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius inkubiert. Dann werden 10 Mikroliter N-Succinyl-Alanin, Alanin, Prolin, Phenolalanin, p-Nitroanilin, das Substrat für Subtilisin A, in einer Endkonzentration von einem KM für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 250 Mikrolitern zugegeben.
Wenn Sie fertig sind, messen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie die optische Dichte bei 405 Nanometern alle 15 Sekunden drei Minuten lang überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen ohne Extrakte während des Ablesens eine gerade Kurve erzeugen. Um die enzymatische Restaktivität zu bestimmen, berechnen Sie das Verhältnis der enzymatischen Aktivität in Gegenwart von Molluskenextrakt zu der in Abwesenheit des Extrakts.
Wenn eine hemmende Aktivität beobachtet wird, messen Sie den Hemmkonzentrationswert 50 oder IC50 unter Verwendung eines Konzentrationsbereichs der Extrakte. Geben Sie eine einzelne Kolonie des C.neoformans H99-Wildtyps mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in fünf Milliliter Hefeextrakt, Pepton, Dextrose oder YEPD-Medium ein und inkubieren Sie sie 16 bis 18 Stunden lang bei 30 Grad Celsius und 200 U / min. Sammeln Sie 500 Mikroliter der Kultur in einer Küvette und messen Sie das Wachstum, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern ablesen.
Verdünnen Sie die Kultur mit Hefestickstoffbase oder YNB-Medium auf eine optische Enddichte von 0,02. Co-Kultur von C.neoformans-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von rohen und geklärten Extrakten durch Mischen von 10 Mikrolitern der Extrakte mit 190 Mikrolitern der verdünnten C.neoformans-Kultur in einer 96-Well-Platte. Messen Sie das Wachstum, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Plattenleser alle 15 Minuten bis zu einer Stunde für 72 Stunden bei 200 U / min und 37 Grad Celsius ablesen.
Die Extrakte von C. chinensis waren in der Lage, die proteolytische Aktivität von Subtilisin A, die mit der Virulenz in Cryptococcus neoformans zusammenhängt, mit einem IC50-Wert von 5,3 Mikrogramm pro Milliliter in Rohextrakten und 4,53 Mikrogramm pro Milliliter in geklärten Extrakten zu hemmen. Die Bewertung der C. chinensis-Extrakte im Vergleich zu Prozessen, die mit der Produktion des C. Neoformans-Virulenzfaktors, einschließlich des Pilzwachstums, verbunden sind, zeigte, dass das Pilzwachstum bei 37 Grad Celsius in Gegenwart der rohen und geklärten C. chinensis-Extrakte signifikant reduziert wurde. Die Bewertung der Extrakte gegen Kapsel-, Melaninproduktion und Biofilmbildung zeigte, dass es keine Veränderungen in der Kapsel- oder Melaninproduktion in Gegenwart von rohen oder geklärten C. chinensis-Extrakten gab.
Es wurde jedoch eine signifikante Verringerung der Biofilmbildung um 70 bis 80 % bei hohen Konzentrationen der Roh- und geklärten Extrakte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle beobachtet. Der Erfolg des Protokolls hängt vom richtigen Extraktionsverfahren ab, einschließlich des Mahlens, der Zugabe der entsprechenden Menge an Enzym und des Ablesens nach der Zugabe des Substrats. Die Technik konzentriert sich auf die thermische Toleranz als wichtigen Kryptokokken-Virulenzfaktor.
Es können jedoch auch andere Virulenzfaktoren wie die Melanin- und Kapselproduktion sowie die Biofilmbildung beurteilt werden. Diese Ergebnisse eröffnen neue Wege, die neue Ansätze für antimykotische Strategien unter Verwendung natürlicher Verbindungen darstellen, die mehr Stabilität und Spezifität bieten und weniger anfällig für Resistenzen sind. Langfristiges Ziel ist es, neue Methoden gegen diese Pilzpathogene zu finden und Resistenzmechanismen zu minimieren.
