Wir danken Santiago Suarez für das kritische Lesen des Manuskripts und Betty Cowgill für Hilfe in der Fotografie. Wir danken auch den anonymen Gutachtern für ihre kritischen Rückmeldungen. Diese Arbeit wird von der Universität Delaware Research Fund unterstützt.

1. Herstellung von Protaminsulfat (PS) Beschichtete Geschirr <ol><li> Vorbereitung 1% igen Lösung von Protaminsulfat (PS) durch Zugabe von 0,5 g PS auf 50 ml entionisiertem, destilliertem Wasser (ddH 2 O) in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schütteln bei hoher Geschwindigkeit auf einer Bank Schüttler bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden, um eine vollständige Auflösung von PS zu gewährleisten. Diese Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate gelagert werden (stellen Sie sicher, gelartige Niederschlag vollständig gelöst vor jedem Gebrauch) 3. </li><li> Nehmen Sie eine Hülse von 60 mm x 15 mm Polystyrol-Petrischalen und legen Sie beide Deckel und Böden auf der Bank. </li><li> Gießen Sie 1% PS-Lösung in jeder Schale (beide Böden und Deckel verwendet werden kann) gerade genug, um die Oberfläche bedecken, lassen Sie mindestens 2 min. Die übrig gebliebenen PS-Lösung können viele Male wiederverwendet werden innerhalb von 3 Monaten bei 4 ° C gelagert werden </li><li> PS-Platz behandelt Gerichte in einem Becherglas mit destilliertem Wasser (dH 2 O) gefüllt. Lassen Sie den Becher unter fließendem dH 2 O für mindestens10 min. </li><li> PS-beschichteten Platten können sofort oder Luft für Lagerung verwendet werden. Cover sie zu Staubansammlung zu verhindern. Sie kann bei Raumtemperatur 1 Monat 3 gespeichert werden. </li></ol> 2. Erhalten Seeigel Gameten und Unbeweglichkeitseffekt die Eier auf einem PS-beschichteten Teller für Mikroinjektion <ol><li> Spawn Seeigel durch Schütteln oder intracoelomic Injektion von bis zu 1 ml 0,5% KCl zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur zu bewegen, Gameten 3 (Abbildung 2) zu lösen. </li><li> Wenn das Tier eine männliche, wie durch die weiße Farbe Spermien angegeben, sammeln Samentrocken von der Oberfläche eines Tieres in ein 1,5-ml-Röhrchen. Trocken Spermien bei 4 ° C eine Woche ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion gespeichert werden. </li><li> Wenn das Tier ein Weibchen, wie die gelbe Farbe aufgrund der Eigelbgehalt angegeben, sammeln seine Gameten durch Eintauchen der gonopores in einem Becher voll von Meerwasser. Die Eier werden von gonopores freigesetzt werden und sich durch die Schwerkraft. &lt;/ Li&gt; <li> Filtern Sie die Eier von Schmutz wie Tier Stacheln mit 80 um Nylon-Mesh-Filter. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Eier innerhalb von 5-7 Stunden nach dem Laichen verwendet. </li><li> Dejelly die Eier: <ol><li> Es werden 100 ml saurem Meerwasser für etwa 1 ml Ei. Verwenden Sie 0,5 M Zitronensäure auf pH-Wert des Meerwassers von pH 8,0 bis 5,1 bis 5,2 einzustellen. Ein zu niedriger pH-Wert der Befruchtung zu verringern und zu hohen pH-Wert wird nicht zulassen, Eier, auf die PS-beschichteten Platten zu befestigen. </li><li> Die Eier (nicht mehr als 1 ml) zu sauren Meerwasser und lassen Sie die Eier auf Eis für 10 Minuten nieder. Alternativ kann die Entfernung des Gelee Mantel unter leichtem Schwenken der Eier während der Behandlung gefördert werden. Man kann effektiv dejelly S. purpuratus Eier in 3-4 min auf diese Weise. </li><li> Vorsichtig abgießen sauren Meerwasser, fügen Sie frisches Meerwasser und lassen Sie die Eier nieder auf Eis wieder. Dejellied Eier auf Eis für bis zu 6 Stunden ohne Befruchtung Probleme gelagert werden </li></ol></li&gt; </ol> 3. Reihe sind die Eier <ol><li> Bereiten 1 M Stammlösung von 3-Aminotriazol (3-AT, MW = 84,08) durch Lösen von 0,84 g 3-AT in 10 ml ddH 2 O. Diese Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Bereiten 1 mM Arbeits Lösung von 3-AT durch Zugabe von 50 ul 1 M Stammlösung zu 50 ml vorgekühltes Meerwasser. Die Lösung wird auf Eis. </li><li> Bereiten Mund Pipette (Abbildung 3) für die schonende Behandlung der Eier: <ol><li> Pipettenspitze manuell von Glasmikropipetten (100 x 1,09 mm OD) gezogen. Halten Sie die Mikropipette mit beiden Händen über dem offenen Feuer. Als das Glas zu schmelzen beginnt, vorsichtig die Enden der Pipette in entgegengesetzte Richtungen ziehen. </li><li> Schließen Sie das eine zog Pipette in ein Kunststoffschlauch (ID 1,14 mm), dicht schliesst mit Parafilm. Die Länge der Rohrleitung sollte ungefähr 50-70 cm. </li><li> Legen Sie eine sterilfiltrierte P20 oder P200 Spitze am Ende des Rohres gegenüber dem Glasrohr zuals Mundstück verwendet werden. </li><li> Clip der Ende des Glasmikropipette mit einer Schere, um den Durchmesser der Spitze einstellen. Der optimale Durchmesser etwas größer als der Durchmesser des Eies (80 &amp;mgr; m). </li></ol></li><li> Gießen 4 ml 1 mM 3-AT Meerwasser in jedem PS-beschichtete Schale (Boden oder Deckel). </li><li> Nehmen Sie die Pipette Mund, legte das P20/P200 Spitze in den Mund und sichern Sie sie mit den Zähnen. Um Eier zu saugen, saugen zuerst eine kleine Menge von Meerwasser. Durch eine Flüssigkeitssäule vor dem Laden der Eier zu erhalten, muß eine maximale Kontrolle über den Mund Pipettierens. </li><li> Positionieren Sie den Mikropipettenspitze in der Nähe der Eier und vorsichtig aspirieren in mehrere hundert Eier in der Pipette. Beschränken Sie die Eier in der Glasmikropipette. </li><li> Row dejellied Eier in einer geraden Linie auf einer Schüssel vorsichtig bläst sie aus dem Mund Pipette während der Bewegung die Spitze in einer geraden Linie. Zeile die Eier direkt vor den Injektionen, weil die Befruchtung Probleme können auftreten, aufgrund prolonged Einwirkung von 3-AT 3 Meerwasser. Außerdem können kationische Klebstoffe wie PS toxisch Eier, und es ist nicht ratsam, Embryonen dieser Reagenzien für längere Zeit ausgesetzt werden, insbesondere wenn die Befruchtung Briefumschläge entfernt wurden. </li><li> Einen Kratzer auf der Schale in der Nähe der Linie der ruderten Eier mit einer Glaspipette. Diese Kratzer wird wichtig sein, die Injektionsnadel zu brechen, um den Fluss der Lösung nach Bedarf anzupassen. Alternativ kann die Kratz vor dem Gießen 3-AT Meerwasser in die Schale gestellt werden. </li></ol> 4. Mikroinjektion von der Sea Urchin Zygotes <ol><li> Schalten Sie die Mikroinjektion Station. Hier beschreiben wir die Verwendung von FemtoJet Einspritzsystem. </li><li> Ziehen Injektionskapillaren mit einer Nadel Magnet. Ein Beispiel eines gut Nadel ist in Fig. 4 dargestellt. Hinweis: Für die RNA-Injektionen, sollte Injektionskapillaren vorbehandelt werden, um Kontamination RNAase 31 zu vermeiden: <ol><li> Platzieren Injektionskapillaren in 50 ml konischenRöhrchen und 50 ml der gefilterten Methanol / HCl (9:1). Gut schütteln und über Nacht verlassen, nicht länger als 10 Stunden. </li><li> Gießen Sie das Methanol / HCl und spülen die Kapillaren mit 2x gefiltert Methanol in das gleiche Rohr. </li><li> Drain Methanol so weit wie möglich zu lyophilisieren und die Kapillaren über Nacht, um eine vollständige Entfernung von Methanol zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Vorsichtig aufsetzen Nadel Kapillare auf einer Nadel Ladehalter und laden Sie es mit &lt;0,5 ul einer Probenlösung mit Microloader Tipps. Probenlösungen enthalten in der Regel 20% Glycerin, je nach der injizierten Materials 3. </li><li> Die Schale mit ruderte Eier auf den Mikroskoptisch (Eier sollte vertikal ausgerichtet, wenn durch die Okulare betrachtet werden) und konzentrieren sich auf die Eier. </li><li> Vorsichtig aufsetzen geladen Nadel auf den Nadelhalter Mikroinjektion und die Position der Nadel zu einem perfekt fokussierten Spitze in der Mitte des Feldes zu haben. </li><li> Drücken Sie die Taste, um den maximalen Druck fo geltenr Nadelreinigung. Lösung sollte aus der Nadel zu kommen. Stellen Sie den Druck, falls erforderlich: Einspritzdruck sollte im Bereich von 90 bis 360 hPa, mit der Kompensationsdruck bei etwa 1/3 des Einspritzdrucks. </li><li> Stellen Sie die Lösungsstrom durch Injektion in unbefruchteten Ei. Mikromanipulator mit einem Joystick, leiten die Spitze der Injektionsnadel auf die unbefruchtete Ei. Um Nadel Eingabe zu erleichtern, erstellen Sie ein leichtes Zittern durch leichtes Ausschlagen der Bühne mit einem harten Gegenstand, zB einem Schraubendreher. Eine Bolus-Injektion in das Ei bilden sollen (Fig. 5) ersichtlich. </li><li> Wenn die Einspritz Bolus nicht sichtbar ist, etwas erhöhen die Spitze der Nadel über die Eier, suchen Sie die Kratzer auf der Schale und stellen Sie in der Mitte des Feldes positioniert werden. Klopfen Sie leicht die Nadelspitze auf die Kratzspur, um die Spitze der Injektionsnadel zu brechen. Einstellen der Einspritzausgleichsdrücke zu gewährleisten, dass der Bolus Injektion nicht mehr als 1/5 von ter Durchmesser des Eis (1-2 pm). </li><li> Sobald die Injektion Bolus kalibriert ist, die Eier zu befruchten, indem verdünnt Spermien (1:1000) oder 1-2 ul der Spermien. Gut mischen sorgfältig verdrängen die Reihe der Eier zu verhindern. </li><li> Start-Injektionen, unmittelbar nachdem die Befruchtung Umschlag sichtbar (Fig. 5) wird. Bewegen Sie sich entlang der Linie der Eier ruderte mit dem Stufenregler und spritzen so viele Zygoten wie möglich durch Stossen sie mit der Nadel durch Mikromanipulator Joystick gesteuert. </li><li> Nach 10-15 min, werden die neu befruchtete Eier werden gehärtet und kann nicht mehr eingespritzt werden. Entfernen Sie die Schale von der Bühne und sorgfältig absaugen aus Spermien in 3-AT Meerwasser mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette. </li><li> Lassen Sie nicht die Zygoten trocken. Schnelles Hinzufügen von frischem Meerwasser vorgekühlten, die Schüssel abdecken. Die Embryonen inkubieren bei 15 ° C. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Mikroinjektion ist eine leistungsfähige Technik für die Bereitstellung von verschiedenen Behandlungen, wie DNA, mRNA, rekombinante Proteine, Funktionsverlust und Überfunktion Reagenzien, Farbstoffe und deren Kombinationen in Eier, Embryonen und Zellen von verschiedenen Organismen, 1-7. Allerdings sollten einige Überlegungen bei der Gestaltung einer Mikroinjektion Experiment gehalten werden. Es ist sehr wichtig, um die Löslichkeit des zuge Behandlung und die Einspritzmenge zu ...

Effiziente und reproduzierbare Behandlung Lieferung ist eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen für Forscher. Mehrere Verfahren wurden eingerichtet, um vorübergehend liefern Behandlungslösungen in die Eier, Embryos, und Zellen. Diese Verfahren umfassen Elektroporation (basierend auf einer Erzeugungs transiente Poren in der Membran unter Verwendung von kurzen elektrischen Impulse) 1,2, Lipofektion (Lieferung durch die Fusion der Behandlung enthaltenden Liposomen mit der Membran) 1, 1 Mikropartikelbeschuss (DNA wird im Mikrometer präzipitiert großen Metallpartikel werden dann verwendet, um die Zellen mit hoher Geschwindigkeit zu durchdringen) und Transduktion (Viren als Träger zur Freisetzung von Transgenen verwendet werden). Im Moment ist die Mikroinjektion der einzige Ansatz, der den Vorteil hat, keine Lösung mit 100% Effizienz mit minimalem Reagenzien enthält. Darüber hinaus kann eine einzelne Injektion Lösung eines Komplexes Cocktail bestehend aus Behandlungen werden. Diese Technik wurde erfolgreich verwendet worden, umly microinject die Eier und Embryonen aus zahlreichen Arten wie Seeigel 3,4, Zebrafisch 5, 6 Maus, Frosch, 7, 8 und Rinder sowie einzelne Zellen in der Gewebekultur-9. Einzel Blastomeren Injektionen in späteren Entwicklungsstadien wurden auch durchgeführt, 10-12. Die aktuellen Methoden der Mikroinjektionen auf der Druckinjektionsverfahren, das ursprünglich von Hiramoto 10 beschrieben wurde, basiert, aber große Fortschritte zur Optimierung dieses Prozesses hergestellt. Ausgezeichnet Mikroinjektion Techniken wurden an anderer Stelle 11 beschrieben, und hier beschreiben wir eines der spezifischen Methoden, die derzeit verwendet wird, um Seeigel (Strongylocentrotus purpuratus) neu befruchtete Eier microinject. Seit über einem Jahrhundert haben Seeigel ein wertvolles experimentelles Modell 15,16. Seeigel sind evolutionär eng mit Chor (uns) und die Analyse von verwandtenihr Genom zeigte, dass sie alle wichtigen Genfamilien wie das menschliche 17 enthalten. Sie produzieren eine große Anzahl von synchron Entwicklung transparenter Embryonen, die leicht manipuliert werden kann. Mit Seeigel als Modellorganismus hat die Seeigel-Community, um unser Verständnis der Befruchtung 18-21, zellbiologische Prozesse 22-24, und der Gen-regulatorischen Netzwerken (KNS) 25-28 beigetragen. Mikroinjektion in Zygoten Seeigel sind mehrere Schritte erforderlich. Zuerst müssen die Eier vor Injektionen (unten beschrieben) immobilisiert werden. Mikroinjektion Speisen werden mit Protaminsulfat (PS), die eine positiv geladene Oberfläche, auf die die negativ geladenen Eier 3 haften schafft beschichtet. Die Eier werden durch Inkubation in saurem Meerwasser (pH 5,15) für 10 min dejellied, gefolgt von zwei Waschungen in natürlichem Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (pH 8,0). Die dejellied Eier werden sorgfältig in einer geraden Linie gerudertin der Mitte der PS-beschichtete Schale in Gegenwart von 1 mM 3-Aminotriazol (3-AT), die erforderlich ist, um die Aktivität von Ovoperoxidase, die aus den kortikalen Granulat des Eies als Folge der Düngung 29 abgesondert wird hemmen. Dieser Schritt ist wichtig, um die Härtung der Befruchtung Hülle zu verhindern und Mikroinjektionsnadel Eingabe zu erleichtern. Als Alternative zu 1 mM 3-AT können 10 mM paraminobenzoic Säure (PABA) verwendet werden. Die Injektionslösung wird in eine Mikroinjektionsnadel, die spezialisierte Microloading Pipettenspitze geladen und auf einem Halter zu Mikromanipulator und Druckeinheit angebracht ist (Fig. 1) montiert. Jede Nadel können einzelne Zygoten in mehreren Versuchen an verschiedenen Tagen microinject werden. Mikroinjektion kann für 10-15 Minuten durchgeführt werden, bis die Zygoten aushärten. Die Zygoten werden dann mit dem Meerwasser und kultiviert bei 15 º C gewaschen Wenn die Embryonen erreichen Brut Blastulastadium, Brut Enzym, das Komponenten des fer verdaut geben sietilization Umschlag 30 und damit sie natürlich aus der PS-beschichtete Schale lösen. Falls erforderlich, können die Embryonen vorsichtig aus der Schüssel mit dem Mund ansaugen oder Pasteurpipette durch sanft weht Meerwasser auf die Embryonen gelöst werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Mikroinjektion von 100-400 frisch befruchteten Eier auf einem einzigen Gericht, die eine Hochdurchsatzverfahren für Downstream-Analysen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

Mikroinjektion in Zellen und Embryonen ist eine übliche Technik, die verwendet wird, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen zu studieren. Bei diesem Verfahren wird eine kleine Menge der Behandlungslösung in einer Mikroinjektionsnadel, die verwendet werden, um physisch injizieren einzelnen immobilisierten Zellen oder Embryonen geladen. Trotz der Notwendigkeit für die Erstausbildung dieses Verfahren für Hochdurchsatz-Lieferung durchzuführen, bietet die Mikroinjektion maximale Effizienz und reproduzierbare Lieferung einer Vielzahl von Behandlungslösungen (einschließlich komplexe Mischungen von Proben) in die Zellen, Eier oder Embryonen. Anwendungen auf Mikroinjektionen Zustellung von DNA-Konstrukte, mRNAs, rekombinante Proteine, Überfunktion, und der Verlust der Funktion Reagenzien. Leuchtstoff-oder farbmetrischen Farbstoff auf der injizierten Lösung gegeben, um sofortige Visualisierung der effizienten Auslieferung sowie ein Tool für zuverlässige Normalisierung der Menge der gelieferten Lösung zu ermöglichen. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Mikroinjektion von 100-400 Seeigel zygotes innerhalb von 10-15 min.

GFP und mCherry Reporterkonstrukte wurden in vitro transkribiert und in die neu befruchtete Eier mikroinjiziert. Embryonen wurden bei 15 ° C für 24 h (bis Blastula-Stadium) inkubiert und abgebildet mit Zeiss Observer Z1 Mikroskop. Die Injektion von Reporterkonstrukte zu keinen Entwicklungsdefekten führen (Abbildung 6). Zur Quantifizierung der Fluoreszenzsignale wurde die Bildaufnahme bei geringer Vergrößerung (100X) durchgeführt, um zu erfassen maximal Fluoreszenz Pixel (6D-F).</s...

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High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Aufrufe.  University of Delaware.  Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern. 

Serie: High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Forschung

Biologie

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...