Wir erkennen an, Bloomington Lager Zentren für die Fliege Belastung. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendium BBSRC (BB / G008973 / 1) unterstützt.

1. Fly Vorbereitung <ol><li> Auskreuzung alle Mutanten, Gal4 / Fachhochschulen und anderen Strecken mit einer Wildtyp-Stamm, wie CSW-, für mindestens sechs Generationen vor den Verhaltensexperimente für genetische Hintergrund 26 steuern. </li><li> Wachsen Fliegen auf einem Standard-Maismehl, Hefe und Melasse Ernährung unter einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C, wenn nicht gezielte Manipulationen erfordern eine andere Temperatur. <ol><li> Um zu bestimmen, die Auswirkungen der transgenen Expression: Verwenden Sie 18 ° C, um die Expression von Transgenen in Gal4 Gal80 ts (TARGET-System) durch Entwicklung zu verhindern und bewegen Sie dann die Fliegen zu einer 30 ° C-Inkubator 1-2 Tage vor dem Verhaltensexperiment. Führen das Experiment bei 30 ° C, um die Auswirkungen der Expression des Transgens 3,4,6,7,14 bestimmen. </li><li> Für Experimente unter Verwendung von wärmeaktivierten TRPA1 Kanäle Neuronen stimulieren Hebe die Fliegen bei 23 ° C, was eine Temperatur bekannt ist,einen inaktiven Kanal zu halten und dann zu einem Verhalten Zimmer verlagern bei 30 ° C, um die TRPA1 exprimieren Neuronen zu aktivieren. </li><li> Für Experimente mit temperaturempfindlichen shibire synaptische Ausgabe 11, 14,24 blockieren: Hinten die Fliegen bei 18 ° C und führen Tests bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln die Fliegen 1-2 Tage vor dem Experiment und zählen sie in Gruppen von etwa 25 unter Licht CO 2 Anästhesie. Speichern die Fliegen mindestens O / N in der Lebensmittelgefäße (ohne Hefe) bei 25 ° C (wenn nicht gezielte Manipulationen erforderlich eine andere Temperatur) und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Klimaraum mit 12.12 h Licht: Dunkelheit, bis die Zeit des Experiments. Hinweis: Diese Lagerung ermöglicht die Fliegen an der anschließenden Lerntest im Klimaraum, die die optimalen Bedingungen für Lernen Drosophila durchgeführt hatte akklimatisieren und, besonders wichtig, entfernt alle täglich ENVIwelt Variationen, die die Verhaltens Phänotyp beeinflusst haben könnten. </li></ol> 2. Vorbereitung vor dem Experiment <ol><li> Führen Sie die Experimente in einem maßgeschneiderten Plexiglas T-Labyrinth (Abbildung 1). </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig die Rohrverbindung, um sicherzustellen, dass eine luftdichte Abdichtung während des Experiments erhalten. Falls nötig, ändern Sie die O-Ringe, die die Innenfächer der T-Labyrinth zu versiegeln. </li><li> Zeigen maßgeschneiderte Kupfergitter im Inneren der Rohre Ausbildung. Kontrollieren und reinigen Sie diese Netze regelmäßig, und wenn oxidiert ersetzen. Befestigen Sie die Kupfergitter, Drähte über Krokodilklemmen, die an einem Schalter-Kasten mit einer elektrischen Stimulator verbunden laufen. Mit einem Voltmeter, um sicherzustellen, dass das Gerät liefert die erforderliche Schock. </li><li> G-Klemmen, um das Labyrinth fest zu halten, um die Luft Auslaufen zu verhindern. </li><li> Befestigen Sie die T-Labyrinth zu Schlauch, der mit einer Luftpumpe läuft, damit Gerüche, über die Fliegen ausgelost und anschließend von der T-Labyrinth entfernt. Pflegen milde Luftfließen bei ~ 2 L / min </li></ol> 3. Geruch Verdünnungen <ol><li> Verwenden Sie zwei verschiedene Gerüche in Konzentrationen, so dass die Fliegen zeigen eine gleiche Vorliebe für beide Gerüche. Verwenden Sie 4-methylcyclohexanol (1:67) und 3-Octanol (1: 100) in Mineralöl 7,13 verdünnt. Hinweis: Diese Konzentrationen, die durch Labor variieren werden sorgfältig zu bestimmen. Zum Beispiel andere verwenden 1.10 für beide Gerüche 24. Andere üblicherweise verwendete Gerüche umfassen Ethylacetat und iso-Amylacetat. </li><li> Pipette 30 ul der verdünnten Geruch in einem maßgeschneiderten Geruch in einer Tasse mit einem Kunststoffrohr mit einem perforierten Oberseite, die Luft über den Geruch in der Tasse gezogen werden können abgedeckt Geruch Block platziert, setzt dadurch die Fliegen zu einer Geruchswolke. </li></ol> 4. Training Protocol (Abbildungen 1 und 2) <ol><li> Für erwachsene olfaktorischen Schock Anlage, führen alle Versuche unter einem schwachen Rotlicht (dh., Rote LED), die der Forscher zu sehen, können aber verhindert, dass die fly vom Sehen, so dass die Fliegen auf den Geruchssinn konzentrieren, im Gegensatz zu visuellen Eingänge. </li><li> Einführung der Fliegen in die Ausbildung Rohr und dann dem T-Labyrinth zu befestigen und ihnen zu ermöglichen, um die Röhre und der Luftstrom 90 s anzupassen. </li><li> Präsentieren die erste Geruch (4-methylcyclohexanol, MCH) mit einem 60-V-Schock (bestehend aus zwölf 1,25 sec Pulse mit 3,75 sec Zwischenimpulsintervalle) für eine Gesamtdauer von 60 Sekunden. </li><li> Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock. </li><li> Präsentieren den zweiten Geruch (3-Octanol, OCT) für 60 Sekunden ohne eine Schock. </li><li> Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock. </li><li> Bewegen Sie die Fliegen aus dem Trainingsraum in der zentralen Kammer des T-Labyrinth durch Drehen des T-Labyrinth auf die Seite und schlug sanft die Unterseite der T-Labyrinth auf einer weichen Oberfläche wie einem alten Mäusematte. Pflegen Sie die Fliegen in der zentralen Kammer für 90 Sekunden. </li><li> Montieren Sie die Wahl Rohre in den bottom der Vorrichtung, um das T-Labyrinth bilden. </li><li> Lernen zu messen, zu bewegen, die Fliegen auf die Wahl Punkt der T-Labyrinth, wo sie gleichzeitig an beide Gerüche ausgesetzt und bewegen sich in Richtung eines. Führen Sie eine Testphase für 120 Sekunden. </li><li> Falle die Fliegen in den Röhren Wahl, indem Sie die zentrale Kammer bis blockieren dadurch die Enden der Rohre Wahl. Sammeln Sie die Fliegen in jedem Arm der T-Labyrinth und in der zentralen Kammer in Essen Fläschchen und Zahl. </li><li> Um Speicher zu messen, sammeln die Fliegen nach dem Training (4.6) und übertragen Sie sie von der T-Labyrinth, um Nahrung Fläschchen ohne Hefe. Shop fliegt im Dunkeln bei 25 ° C und 70% Luftfeuchte für die verbleibende Zeit notwendig, um die Speicherphase von Interesse zu bestimmen (siehe Einleitung). Wieder einführen, die Fliegen an der T-Labyrinth wie in Stufe 4.7. </li><li> Für das Langzeitgedächtnis, verwenden Sie eine benutzerdefinierte gebaut Labyrinth, die mehrere Chargen von Fliegen, gleichzeitig trainiert werden können. Verwalten 5 Zyklen der Ausbildung mit 15 min inter-Zyklusintervall (spaCED) oder ohne inter-Zyklusintervall (massiert). Halten die Fliegen bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit bis zur Prüfung. Vor der Prüfung zu bewegen, die Fliegen bis 25 ° C und es ihnen ermöglichen, für mindestens 1 Stunde akklimatisieren. Beurteilen Langzeitgedächtnis 24 Stunden nach dem Training. </li><li> Nach den Verhaltensexperimenten, reinigen Sie die Geruchs Tassen mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos. Nach dem Trocknen Mantel die Tassen mit 10 ul Sigmacote. Trockne die Sigmacote durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. Gelegentlich reinigen Sie den T-Labyrinth Plexiglasröhren und Geruch Blöcke mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos. </li></ol> 5. Die Berechnung der Performance-Index: ein Maß für die Fliegen &#39;Memory <ol><li> Berechnung des Leistungsindex (PI) für jede Bedingung wie die Anzahl der Fliegen Vermeidung der Schock-gekoppelten Geruch (CS -) minus die Anzahl der Fliegen Wahl der Stoß gepaart Geruch (CS +), geteilt durch die Gesamtzahl der Fliegen (CS - + + CS) 1. Performance Index (PI) = (# CS - fliegt - # CS + fliegt) / (# Gesamtlinie) </li><li> Berechnen Sie die letzte PI des Experiments durch Mittelung der PI der Versuch, bei dem MCH war der Schock gepaarten Geruch und eine, in der Oktober war der Schock gepaarten Geruch. Dies entfernt jegliche Vorspannung der Fliegen, die eine höhere Präferenz für einen Geruch. </li></ol> 6. Sensomotorische Kontrollen <ol><li> Führen Geruchsschärfe durch die Einführung von ~ 40-50 Fliegen in der T-Labyrinth 6,7,17. </li><li> Nach 90 sec, bewegen die Fliegen auf die Wahl Punkt, und es ihnen ermöglichen 2 min zwischen reinen Gerüche und Luft wählen. </li><li> Sammeln und zählen Sie die Fliegen. Berechnen der Vermeidung Prozentsatz durch Dividieren der Gesamtzahl der Fliegen, die den Geruch von denen, die in dem Test teilgenommen gewählt. </li><li> Schock für Reaktivität 6,7,17, stellen die Fliegen in den Schockraum. </li><li> Nach 90 Sekunden der Ruhe, zu verwalten eine 60-V-DC-Stromschlag, von dem die Fliegen können zu einem ähnlichen entkommenRohr ohne ein Schock. </li><li> Lassen Sie 2 min für die Fliegen zu wählen; sammeln und zählen die Fliegen. Berechnen der Stoßvermeidungsprozent, indem die Anzahl der Fliegen, die den Schock vermieden durch die Flucht des Stoßwellenrohrs mit der Gesamtzahl der in dem Experiment entfernt. Sind die Fliegen, die in der zentralen Kammer in der Gesamt von denen, die den Elektroschock entgangen sein. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Drosophila erwachsenen Riech Schock Lern Assay ermöglicht hier vorgestellten Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen verschiedenen Phasen der Erinnerung, einschließlich Langzeitgedächtnis 15-17. Sowie die Bestimmung der Wirkung von circadianen Rhythmen 18, 19 Schlaf, Ernährung 20,21, Seneszenz 11-13, neurodegenerative Erkrankung, 5 und medikamentöse Behandlungen auf 5,6,19 Speicher. Viele mächtige Ansätze wurden vor kurzem für die funktionelle Bildgebung der neuronalen Schaltkreise, die olfaktorische Gedächtnis in Fliegen 3,4,7,11,16,27 vermitteln entwickelt. Diese optogenetischen Techniken verwenden, die große Repertoire der verschiedenen Promotoren in Drosophila 14,16. Diese Promotoren werden verwendet, um genetisch kodierte Kalzium und cAMP-Reporter in den Speicher Neuronen 16,27 äußern, um die Wirkung von bestimmten Gen-Mutationen auf Erinnerungsspuren zu untersuchen. The Einsatz von Promotoren und bedingte Mutationen bei Erwachsenen ermöglicht die Untersuchung des postEntwicklungs Rolle eines Genprodukts im Speicher 3,4,6,7,13,14. Bildgebung und Verhaltens Ansätze mit licht-und wärmeaktivierte Kanäle zu stimulieren oder zu hemmen verschiedene Neuronen in der Speicherschaltung 11,14,16,22-24 ihrer Funktion weiter aufzuklären kombiniert werden. Außerdem Pilzkörper Neuronen Speicher zugänglich sind Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen 28 und mathematische und computergestützte Techniken werden eingesetzt, um Drosophila Riech Speicher 29 zu modellieren. Diese experimentellen Fortschritte, kombiniert mit den verschiedenen Formen der hier vorgestellten Assoziativspeicher Protokolle ermöglichen Drosophila verwendet werden, um die molekular und Schaltungsebene Veränderungen in assoziativen Speicher, die in Reaktion auftreten, zu belohnen, Strafe, Motivation, Sucht-Modell werden, Altern und Krankheit 5,6,11-13,16,30-31.

Die hier vorgestellte Methode ist, dass durch Tully und Quinn mit einigen kleinen Modifikationen 1 beschrieben. Der Versuch wird in zwei Phasen durchgeführt: die Fliegen in der ersten Phase ausgebildet und die ausgebildeten Fliegen werden in der zweiten Phase getestet. Während der Ausbildung sind eine Gruppe von Fliegen gleichzeitig Geruch ausgesetzt 1 (CS +) und einen elektrischen Schlag (US) in einem Trainings Röhre. Die Fliegen erhalten dann Geruch 2 (CS -) ohne einen elektrischen Schlag. Diese einzige Paarung von einem bestimmten Geruch mit einem Schock wird als 1-Zyklus-Ausbildung, und die Gerüche, die am häufigsten verwendet werden, sind 4-methylcyclohexanol (MCH) und 3-Octanol (OCT). Ein-Zyklus-Training führt zur Bildung eines labilen Phase des Speichers, der für bis zu 7 Stunden nachgewiesen werden kann; jedoch ist der Speicher in der Regel sofort getestet, um festzustellen, was bezeichnet Lernen, Erwerb oder 2 min Speicher. Speicher gemessen bei 30 min oder 1 h wird als Kurzzeitgedächtnis bezeichnet, während3 Stunden Speicher wird als Halbzeit-Speicher bezeichnet. Die Belichtung von Fliegen zu wiederholende Trainingszyklen mit Lücken zwischen den Trainingszyklen (Abstand Training) führt zu einer konsolidierten Form von Langzeitgedächtnis, das CREB-Transkriptions abhängig ist und dauert bis zu einer Woche. Training ohne Lücken (massierten Ausbildung) führt zur Bildung von Anästhesie-resistenten Speicher (ARM), die ähnlich wie das Langzeitgedächtnis, wird typischerweise nach 5 Zyklen Ausbildung 7,13,15-17,20,21 gemessen 24 Stunden. Mit diesem Ansatz kann die Wirkung verschiedener Gen-Mutationen in diesen verschiedenen Phasen des Speichers bestimmt. Der Promotor getriebene Expression von licht oder temperaturempfindlichen Transgene zu aktivieren oder blockieren die neuronale Aktivität bestimmter Nervenzellen erlaubt es, zu untersuchen, welche Nervenzellen für Speicher Akquisition, Konsolidierung und Wieder 3,4,11,15,16,20 erforderlich sind, 22-24. Speicher bei 1 h wird in der Regel gemessen, wenn das Studium altersbedingten Gedächtnisstörungen, da diese form von Speicher scheint besonders anfällig für die Auswirkungen der Alterung 11-13. Eine vollständige Palette von Verhaltens-und genetischen Kontrollen mit Memory-Experimente durchgeführt, um beispielsweise festzustellen, ob eine Leistung, Mangel wegen eines zentralen Speicher-Defekt oder eine periphere sensorische Defekt, der die Fliege verhindert Erfassung der Schlag oder olfaktorische Stimmung 5 -7, 1 7, 25,26.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

Drosophila in klassischen Konditionierung Experimente über 40 Jahren verwendet worden, so stark erleichtert das Verständnis des Speichers, einschließlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen der kognitiven Erkrankungen 1-7 beteiligt. Lernen und Gedächtnis in Larven, die Wirkung von Neuroentwicklungsgene 8-10 studieren und in Fliegen untersucht werden, um den Beitrag der Erwachsenen Plastizität Gene 1-7 messen. Darüber hinaus ist die kurze Lebensdauer von Drosophila erleichtert die Analyse von Genen der Vermittlung altersbedingten Gedächtnisstörungen 5,11-13. Die Verfügbarkeit von vielen Promotoren, die das Nervensystem zu unterteilen Drosophila macht es möglich zu bestimmen, wann und wo ein Gen von Interesse für normale Speicher sowie Relais verschiedener Aspekte des Verstärkungssignals 3,4,14,16 erforderlich. Studieren Speicher bei erwachsenen Drosophila ermöglicht eine detaillierte Analyse derVerhalten und Komponenten bestehen und eine Messung des Langzeitspeichers 15 -17. Die Länge der erwachsenen Stadium beherbergt längerfristigen genetischen, Verhaltens-, Ernährungs-und pharmakologische Manipulationen des Gedächtnisses, zusätzlich zur Bestimmung der Wirkung des Alterns und neurodegenerativer Erkrankungen auf der Speicher 3-6,11-13,15-21. Klassische Konditionierung wird durch die gleichzeitige Präsentation einer geruchsneutral Cue (bedingten Reiz, CS +) und einer Verstärkung Stimulus, wie zB., Einem elektrischen Schlag oder Saccharose, (unbedingter Reiz, USA), die miteinander durch das Tier assoziiert werden induziert 1,16. Eine zweite bedingten Reiz (CS -) wird anschließend ohne die USA vorgestellt. Während der Testphase werden Drosophila gleichzeitig mit CS + und CS-Gerüche präsentiert. Nachdem die Drosophila Zeit zwischen den Gerüchen wählen vorgesehen, ist die Verteilung der Tiere aufgezeichnet. Dieses Verfahren alTiefs assoziativ aversiven oder appetitive Anlage zuverlässig ohne Vorspannung, die durch die angeborene Vorliebe für eine der beiden Reize konditioniert eingeführt gemessen werden. Verschiedene Kontrollexperimente werden auch durchgeführt, um zu testen, ob alle Genotypen reagieren normalerweise auf Geruch und Verstärkung allein.

Der Leistungsindex (PI) dient als Maß für die Speicher. Tabelle 1 stellt eine repräsentative Berechnung PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH gepaart mit Schock </td><td> 3-OCT gepaart mit Schock </td></tr><tr><td> Fliegen vermeiden MCH (in OCT-Rohr) = 80 Fliegen lieber MCH (MCH in Rohr) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Fliegen vermeiden OCT (MCH in Rohr) = 75 Fliegen lieber OCT (OCT Rohr) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0,5 </td></tr><tr><td> PI des Experiments = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ein Vertreter Berechnung des Performance-Index mit anschaulichen Daten. Leistungsindizes für verschiedene Experimente können verglichen werden, um Memory-Effekte aufzuklären. Sobald solchVergleich ist in Figur 3, die die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten mit Canton S erwachsenen Fliegen Wildtyp (WT) und mutierten dunce Lern erwachsenen Fliegen 1 ausgeführt enthält gezeigt. Der Mittelwert von 10 PIs vorgesehen ist, wobei die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert (SEM). Diese Ergebnisse zeigen, dass Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in das Lernen im Vergleich zum Wildtyp. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die erwachsenen Versuchsaufbau. Die Fliegen sind geschult und in einem T-Labyrinth getestet. Die Ausbildung beinhaltet die Präsentation einen Geruch A mit elektrischer Schlag, gefolgt von einem zweiten Geruch B ohne elektrischen Schlag. Nach einer Ruhezeit in der mittleren Kammer die Fliegen mit den beiden Gerüche gleichzeitig präsentiert. Die Fliegen sind gefangenin den beiden Röhren und gesammelt und gezählt, um Lernen / Speicherstände zu erhalten. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Erwachsenenbildung Protokoll. Die Fliegen werden in zwei Schritten trainiert. Der erste Schritt, wo Fliegen erhalten einen Geruch (CS +), gepaart mit Elektroschock (US) für 60 Sekunden. Im nächsten Schritt erhalten fliegt eine zweite Geruch (CS) ohne elektrischen Schlag. Fliegen werden dann für 90 Sekunden, wonach sie für ihre Wahl zwischen CS und CS + getestet ruhen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Abbildung 3. Ein Vertreter Graph, der Dummkopf und Wildtyp Lernen in der Erwachsenen Drosophila. </strong&gt; WT und Narren Fliegen wurden folgende einer Sitzung der Ausbildung geprüft. Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in Learning im Vergleich zum WT (n = 10).

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Die Methode, die erwachsenen Drosophila Assoziativspeicher messen beschrieben. Der Test basiert auf der Fähigkeit der Fliege, einen Geruch mit einem negativen Verstärker (elektrischer Schlag) vorgestellt verbinden und dann erinnern diese Informationen zu einem späteren Zeitpunkt, so dass Speicher gemessen werden kann.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.7K Aufrufe.  University of Bristol.  Die Methode, die erwachsenen Drosophila Assoziativspeicher messen beschrieben. Der Test basiert auf der Fähigkeit der Fliege, einen Geruch mit einem negativen Verstärker (elektrischer Schlag) vorgestellt verbinden und dann erinnern diese Informationen zu einem späteren Zeitpunkt, so dass Speicher gemessen werden kann. 

Serie: Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em&gt; Drosophila</em&gt; In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Geschmackspräferenz Assay für Erwachsene<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.