Funktionelle Studien von Rickettsia-Genen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese, daher benötigen wir zuverlässige Methoden, um die Gene kontrolliert zu verändern. Unser Protokoll verwendet Elektroporation, um exogene DNA in obligate intrazelluläre Bakterien der Gattung Rickettsia einzuführen, wodurch wir die Auswirkungen der eingeführten DNA untersuchen können. Gemeinsam mit mir wird heute Lisa Price, Forscherin aus dem Labor von Dr. Munderloh und Dr. Kurtti, das Verfahren demonstrieren.
Um zu beginnen, bereiten Sie eine 90 bis 100% Rickettsia parkeri-infizierte ISE6-Zellkultur vor, wie im Text beschrieben. Um dann die Infektionsrate durch Giemsa-Färbung zu bestimmen, verdünnen Sie die Zellsuspension auf ein Verhältnis von 1:5 mit vollständigem Medium und geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension durch Zentrifugation bei 113 G für fünf Minuten auf einen Glasmikroskopobjektträger. Nachdem Sie den Schieber an der Luft trocknen lassen, fixieren Sie ihn fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit absolutem Methanol.
Dann inkubieren Sie den Objektträger und die Giemsa-Färbung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes spülen Sie den Objektträger in Wasser ab und betrachten Sie ihn nach dem Trocknen unter einem Lichtmikroskop mit Ölobjektiven. Bestimmen Sie den Prozentsatz der infizierten Zellen, indem Sie die infizierten und nicht infizierten Zellen zählen.
Zur Herstellung der zellfreien Rickettsia parkeri gießen Sie etwa 0,2 Milliliter sterile 60 bis 90 Siliziumkarbidkörnung in zwei zwei Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhrchen und stellen die Röhrchen beiseite. Aus einem zuvor inokulierten Rickettsia parkeri-infizierten Kolben mit fünf Milliliter Medium zwei Milliliter des Mediums entfernen und darauf achten, die Zellschicht nicht zu stören. Dann resuspendieren Sie die Zellen mit den verbleibenden drei Milliliter des Mediums.
Teilen Sie diese Aufhängung gleichmäßig auf die beiden vorbereiteten Silikonkarbid-Sandschläuche auf und wirbeln Sie das Rohr 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit durch. Dann legen Sie sie auf Eis. Als nächstes bereiten Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Luer-Lock-Spritze vor, indem Sie den Kolben verlängern und das Kolbenende in eine Polystyrolbasis einführen, die zur Aufnahme konischer 15-Milliliter-Röhrchen verwendet wird.
Entfernen Sie mit einer Barriere-Zwei-Milliliter-Pasteur-Pipette, die mit einem Gummikolben betrieben wird, vorsichtig den Überstand der Wirbelzellen, ohne Körnung anzusaugen. Führen Sie dann die Pipettenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Als nächstes filtrieren Sie die Rickettsia parkeri-Kultur in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen durch einen sterilen Zwei-Mikrometer-Porenfilter auf der Spritzennabe und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach dem Entfernen des Überstands waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 1,2 Milliliter 300-Millimolar-eiskalter Saccharoselösung. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie den Überstand zwischen den Waschgängen. Am Ende der Zentrifugation wird das gepoolte Zellpellet mit 100 bis 150 Mikrolitern eiskalter Saccharoselösung für zwei bis drei Transformationsproben resuspendiert.
Dann teilen Sie die Probe in 50-Mikroliter-Aliquots in vorgekühlten, sterilen 1,5-Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Umwandlung bei drei Mikrogramm endotoxinfreier pRAM18sSFA-Plasmid-DNA in jedes Röhrchen mit 50 Mikrolitern Rickettsia parkeri auf Eis und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren. Die Mischung wird in eine vorgekühlte sterile Elektroporationsküvette mit einer Spaltgröße von 0,1 Zentimetern überführt.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und brüten Sie 10 bis 30 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entfernen Sie das Medium aus einem vollständig konfluenten zuvor kultivierten ISE6-Zellkulturkolben und resuspendieren die Zellschicht, indem Sie die Zellen vorsichtig mit 1,5 Milliliter frischem Medium spülen, das Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer enthält. Nach der Erzeugung einer homogenen Zellsuspension wird das gesamte Volumen in ein einziges steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Als nächstes elektropolieren Sie die Rickettsia parkeri und die Plasmid-DNA-Mischung unter Verwendung eines Elektroporators. Verwenden Sie nach der Elektroporation eine sterile verlängerte Feinspitzenpipette, um eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension in die Küvette zu überführen, und pipetten Sie vorsichtig auf und ab, um die elektropolierte Rickettsia parkeri zurückzugewinnen. Dann wird der Inhalt der Küvette in das Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt, das den Rest der ISE6-Zellsuspension enthält.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur, zuerst bei 700 G für zwei Minuten, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, und dann bei 13, 600 G für eine Minute, um die Rickettsia herunterzuziehen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 34 Grad Celsius für 15 Minuten bis eine Stunde. Nach der Inkubation wird der resuspendierte Inhalt einer Transformation in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben mit 3,5 Milliliter frischem Medium mit Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer überführt.
Schaukeln Sie den Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen und bei 34 Grad Celsius zu inkubieren. Nach 16 bis 24 Stunden jeweils 10 Mikroliter Spectinomycin und Streptomycin in den inkubierten Kolben geben. Schütteln Sie den Kolben, um die Antibiotika gleichmäßig in das Medium zu mischen, bevor der Kolben in den Inkubator zurückgebracht wird.
Die erfolgreiche Vermehrung von Wildtyp-Rickettsia parkeri- und ISE6-Zellen wurde durch Giemsa-Färbung nachgewiesen. Die mit Giemsa dunkelviolett gefärbten Kerne der ISE6-Zellen sind sowohl im intrazellulären als auch im extrazellulären Rickettsi sichtbar. Die Transformation von Rickettsia parkeri, die das rote Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimiert, wurde nach sieben Tagen Inkubation durch konfokale Mikroskopie bestätigt.
Ein erheblicher Anstieg der Infektionsrate wurde nach 10 Tagen beobachtet. Halten Sie alles während des gesamten Verfahrens steril. Achten Sie auf Details und seien Sie geduldig, da einige Arten von Rickettsien lange brauchen, um sich zu transformieren, insbesondere langsam wachsende Endosymbionten.
Dieses Protokoll hat die Untersuchung mehrerer Aspekte der Rickettsienbiologie und ihrer Interaktionen mit ihren Arthropodenvektoren und Säugetierwirten ermöglicht. Zum Beispiel wurden fluoreszierende Protein-exprimierende Rickettsi verwendet, um Motilität und Symbionten-Zeckenzell-Interaktionen zu verfolgen.
