Diese Arbeit wurde durch Stipendien an ED aus der James S. McDonnell Foundation 21 st Century Award Program und ein NIH Director des New Innovator Award unterstützt. GAB wurde zum Teil durch ein Postdoc-Stipendium am California Institute of Regenerative Medicine unterstützt.

1. Qualitätskontrolle Analyse der RNA-Probe mit 2100 Bioanalyzer Bevor Sie beginnen, <ol><li> Denaturieren die Leiter und Ihre Proben bei 70 ° C für 10 min. Gefühlt sofort auf Eis. </li><li> Reinigen Sie das Instrument Elektroden mit RNaseZAP für 1 min, durch RNase-freies Wasser für 10 sec folgte. Lassen Sie die Elektroden an der Luft trocknen. </li><li> Bereiten Sie die Gel-Matrix durch Pipettieren 550 ul der Gel-Matrix in einen Spin Filter mit dem Kit bei. Zentrifuge bei 1.500 RCF für 10 min bei Raumtemperatur. Aliquot der gefilterten Gel in 65 ul Aliquots und lagern bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li><li> Zur Vorbereitung der Chip Priming Station, <ol class="lalpha"><li> Legen Sie eine 1-ml-Spritze durch den Clip und in den Luer-Lock-Adapter. </li><li> Stellen Sie die Grundplatte an C durch Lösen der Schraube unter der Basis, die Aufhebung der Platte und Nachziehen der Schrauben Position. </li><li> Passen Sie die Spritze Clip in die obere Position. </li></ol></li><li> Äquilibrieren der Farbstoffkonzentrat auf Raumtemperatur. Vortex für 10 Sekunden. Add 1 ul Farbstoff ein 65 ul-Aliquot der gefilterten Gel. Vortex gut und Zentrifuge bei 13.000 RCF für 10 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie innerhalb eines Tages. Wenn Sie bereit sind Ihre Proben ausgeführt werden, </li><li> Position ein Chip auf der Grundierung entfernt. In diesem Protokoll sind wir mit RNA 6000 Nano-Chips. Um das Gel laden, <ol class="lalpha"><li> Pipette 9 ul des Gel-Farbstoff-Mix in den Brunnen mit einem weißen &quot;G&quot; vor einem schwarzen Hintergrund markiert. Achten Sie darauf, Ihren Tipp ganz am Ende der gut positioniert ist. </li><li> Position der Spritze mit 1 ml. Schließen Sie die Grundierung Station. Stellen Sie sicher, Klick-Schlösser. </li><li> Drücken Sie den Kolben langsam, aber stetig, bis sie durch den Clip gehalten wird. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden. Lassen Sie die Clips. </li><li> Lassen Sie den Kolben nach oben von allein. Nachdem er aufhört sich zu bewegen, für ein paar Sekunden warten, und ziehen Sie den Kolben zurück, um die 1 ml Position. Öffnen Sie die Grundierung Station. </li></ol></li><li> Pipette 9 ul des Gel-Farbstoff-Mix in jedem der 2 Brunnen mit der Aufschrift &quot;G&quot;. </li><li> Je 5 ul des Markers in jeder der 12 Proben Brunnen und in die Leiter gut. </li><li> Pipette 1 ul der vorbereiteten Leiter in Ladder gut. </li><li> Pipette 1 ul jeder Probe in der Probe Brunnen. </li><li> Pipette 1 ul der Marker in jeder ungenutzten Probe gut. </li><li> Vortex den Chip für 1 min bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Um den Chip laufen, <ol class="lalpha"><li> Anfang der 2100 Expert Software. </li><li> Positionieren Sie den Chip und den Deckel schließen. Wenn das Gerät online ist, wird ein Symbol zeigen, ob der Deckel offen oder geschlossen ist und welche Art von Chip eingesetzt wird. Stellen Sie sicher, den richtigen Anschluss gewählt ist. </li><li> Führen Sie den Test innerhalb von 5 min von dem Laden der Proben, um Verdunstung zu verhindern. </li></ol></li></ol> 2. Amplifikation und Markierung Zur Vorbereitung für die Microarray-Analyse werden RNA-Proben amplifiziert und beschriftet, in der Regel in einer Reaktion auf T7-RNA-Polymerase 3. Doppelsträngigen cDNA durch reverse Transkription erzeugt. cDNA wird in einem in vitro Transkriptions-Reaktion eingesetzt zu generieren, was als cRNA bekannt. Diese Reaktion wird in Gegenwart von markiertem Ribonukleotiden durchgeführt, Herstellung Mikrogramm-Mengen von markierten RNA für Array-Hybridisierung. Die Wahl der Verstärkung / Kennzeichnung Methoden hängt von den nachfolgenden Microarray-Plattform verwendet werden. In diesem Abschnitt beschreiben wir die Erzeugung von fluoreszenzmarkierten RNA mit Hilfe von Agilent Quick-Amp Labeling Kit. <ol><li> Je 50 ng bis 5 ug RNA in ein 1,5 ml-Tube. Das Volumen sollte nicht mehr als 8,3 pl. Wenn nötig, konzentrieren Sie Ihre RNA Probe durch Vakuumzentrifugation oder Fällung mit Alkohol. </li><li> Add 1,2 ul der T7-Primer. </li><li> Bringen Sie auf ein Endvolumen von 11,5 ul mit RNase-freiem Wasser. </li><li> Inkubation bei 65 ° C für 10 min auf die RNA zu denaturieren. Wir empfehlen die Verwendung eines Thermocycler mit einem heißen Deckel, um Kondensation in der Spitze des Rohres zu verhindern. </li><li> Während der 10 min Inkubation, warm 5X First Strand Buffer zu 80 ° C für 5 min. Vortex-und Spin-Down. Halten Sie bei RT bis zur Verwendung. </li><li> Nach der 10 min Inkubation schnell die denaturierte RNA-Proben auf Eis abkühlen. </li><li> Bereiten Sie die cDNA-Mastermix. Per Reaktion, fügen Sie die folgenden: <ol class="lalpha"><li> 4 ul 5X First Strand Buffer </li><li> 2 ul 0,1 M DTT </li><li> 1 ul 10 mM dNTPs </li><li> 1 ul MMLV-RT-Enzym </li><li> 0,5 ul RNase Out. </li></ol></li><li> Mix-Komponenten durch Invertieren des Röhrchens 4 mal. Nicht vortexen. Spin down, um den Inhalt auf den Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Add 8,5 ul Mastermix pro Probe. Mix durch Pipettieren rauf und runter. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 40 ° C, gefolgt von 10 min bei 65 ° C. Wir empfehlen die Verwendung eines Thermocycler mit beheiztem Deckel. </li><li> Übertragen Sie die Rohre auf Eis für 5 min. </li><li> Bereiten Sie die Transkription Master-Mix. Per Reaktion, fügen Sie die folgenden: <ol class="lalpha"><li> 15,3 ul Nuklease-freies Wasser </li><li> 20 pl4X Transkriptionspuffer </li><li> 6 ul 0,1 M DTT </li><li> 8 ul NTPs </li><li> 6,4 ul 50% PEG (PEG soll auf 40 ° C vorgewärmt werden und verwirbelt, um sicherzustellen, Resuspension) </li><li> 0,5 ul RNase Out </li><li> 0,6 ul anorganischer Pyrophosphatase </li><li> 0,8 ul T7-RNA-Polymerase </li><li> 2,4 ul Cy3-oder Cy5-CTP </li></ol></li><li> Kurz Spin der Proben, um den Inhalt auf den Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Add 60 ul Transkription Master Mix pro Probe. </li><li> Inkubation bei 40 ° C für 2 Stunden. </li><li> Add 20 ul RNase-freiem Wasser. </li><li> Purify der markierten cRNA auf unincorporated Nukleotide zu entfernen. Wir empfehlen die Verwendung von Qiagen RNeasy Mini-Säulen. </li><li> Quantifizierung der markierten cRNA. Wir empfehlen die Verwendung eines NanoDrop2000 Spektralphotometer in Microarray Messmodus. Wählen Sie unbedingt RNA-40 als die Art der Probe. </li><li> Rekord Probenkonzentration, Ausbeute (berechnet als die Konzentration durch das Volumen multipliziert) und spezifische Aktivität (berechnet als 1000 durch das Verhältnis von Farbstoff-Konzentration über cRNA Konzentration multipliziert). Für Microarray-Hybridisierung, ist es notwendig, eine Ausbeute von einem Mindestgewicht von 825 ng und eine spezifische Aktivität von mindestens 8 pmol / ug zu erreichen. </li></ol> 3. Microarray-Hybridisierung <ol><li> Schalten Sie den Hybridisierungs-Station und stellen bei 65 ° C mindestens 2 Stunden vor der Hybridisierung beginnt. </li><li> Zur Vorbereitung der Hybridisierung Probe, mischen Sie die folgenden in einem 1,5 ml-Tube: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3-cRNA (dies ist in der Regel Ihre &quot;behandelt&quot; sample) </li><li> 825 ng Cy5-cRNA (dies ist in der Regel Ihre &quot;Referenz&quot;-Probe) </li><li> 11 ul 10x Blocker. </li><li> Add RNase-freiem Wasser auf ein Endvolumen von 52,8 ul </li><li> Add 2,2 ul Fragmentierung Puffer. </li></ol></li><li> Vortex bei niedriger Geschwindigkeit zu mischen. </li><li> Inkubation bei 60 ° C für genau 30 min. Dies ist die cRNA Fragmentierung Schritt, der markierten Fragmente erzeugt für Array-Hybridisierung. Es ist sehr wichtig, um inkubieren genau wie beschrieben. Wir empfehlen die Verwendung von einem Thermocycler mit beheiztem Deckel. Es ist sehr wichtig, um inkubieren genau so, wie beschrieben, um Sonden der richtige durchschnittliche Länge zu generieren. Übermäßiges oder ungenügendes Fragmentierung wird in falsch-negativen oder falsch positiven Ergebnis. </li><li> Add 55 ul 2X Hybridisierungspuffer, um die Fragmentierung zu stoppen. Mix durch Pipettieren, wobei besondere Sorgfalt nicht zu Blasen führen. </li><li> Säule für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit, um den Inhalt auf den Boden des Röhrchens zu sammeln. Wenn Blasen beobachtet werden, mehr Zentrifuge, um sie zu entfernen. </li><li> Das Röhrchen auf Eis, aus dem Licht geschützt. Legen Sie die Probe auf dem Array so schnell wie möglich. </li><li> So laden Sie das Array, bereiten Sie zunächst die Hybridisierung Kammer. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Agilent 4x44K Arrays mit dem Roche-NimbleGen Hybridisierung und A4 Mischer Kammern. <ol class="lalpha"><li> Legen Sie eine Microarray-Folie in der Montage / Demontage-Werkzeug, Barcode-Seite zuerst. </li><li> Öffnen Sie ein A4-Mixer und die Klebefläche freizulegen. Halten Sie die Array-und Montage / Demontage-Werkzeug, um jede Bewegung zu vermeiden, legen Sie das A4-Mixer auf der Folie, beginnend am hinteren Ende. Stellen Sie sicher, es richtig ist, um das Werkzeug ausgerichtet. Kleben Sie den Mixer auf der ganzen Array schieben. </li><li> Ziehen Sie aus dem Ende des Mischers, um die Folie / Mischgruppe entfernen. </li><li> Mit dem Geschrei Werkzeug, drücken Sie die ganze Zeit den Klebstoff Dichtung um sicherzustellen, dass es eng wird theslide geklebt. Kleine Luftblasen zwischen dem Kleber und die Folie eingeschlossene Luft kann vor einem dunklen Hintergrund gesehen werden. Nehmen Sie zusätzliche Zeit, um diese Blasen mit dem Geschrei Werkzeug zu entfernen. Ihr Array ist nun geladen werden. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette auf 100 ul der Hybridisierung Probe zu laden. Schieben Sie die Spitze fest im Hafen Loch, dann langsam und gleichmäßig so zu verzichten, dass keine Luft in dem Array-Bereich eingeschlossen. Versuchen Sie niemals, das Sample bis zu saugen. Sobald die gesamte Probe verzichtet hat, halten Sie die Spitze auf den Hafen Loch ohne Loslassen des Kolbens. Wenn die Probe das gesamte Array deckt und Flüssigkeit beginnt zu kommen die Entlüftungsöffnung, schnell zu entfernen, die Pipette. Nur lassen Sie die Kolben einmal die Spitze weg von der Folie. </li><li> Vorsichtig abtupfen die überschüssige Flüssigkeit an beiden Ports. Achten Sie darauf, nicht zu ziehen Probe aus der Kammer selber. </li><li> Decken Sie die Bullaugen mit Aufklebern mit einer Pinzette. </li><li> Setzen Sie den Schieber auf der Hybridisierung Station, und überprüfen Sie, ob die Blase Löcher korrekt über die O-Ringe positioniert. Dadurch wird sichergestellt, gute Durchmischung während der Hybridisierung. </li><li> Schließen Sie die Schieber und die Station Deckel. Stellen Sie die Station Mischen-Modus B. </li><li> Hybridisieren das Array bei 65 ° C für 17 Stunden. </li><li> Bereiten Waschpuffer 2 durch Zugabe von Triton X-102 zu einer Endkonzentration von 0,005%. Halten bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 4. Microarray Waschen <ol><li> Add Triton X-102, um Buffer 1 bis zu einer Endkonzentration von 0,005% Wash. Halten Sie bei Zimmertemperatur Temperature. </li><li> Wenn Hybridisierung abgeschlossen ist, füllen Sie eine Glasschale &quot;A&quot; mit Waschpuffer 1. Das Gericht sollte groß genug sein, um die Montage / Demontage-Werkzeug zu halten und damit einige Manöver als auch. Alle Wäschen sollte in Gläser getan werden. Vermeiden Sie Plastikgeschirr, da sie auslaugen Verbindungen was zu hohen Hintergrund im Array neigen. </li><li> Legen Sie ein Dia-Rack und einem Rührstab in einer Färbung Gericht &quot;B&quot;. Füllen mit Waschpuffer 1, sicherstellen, dass es deckt die Rack. Legen Sie auf einer Rührplatte bei Raumtemperatur. </li><li> Setzen Sie einen Rührstab auf einem leeren Flecken dish &quot;C&quot; und auf eine Rührplatte. </li><li> Entfernen Sie das Array und steckte es in die Montage / Demontage-Werkzeug. Tauchen Sie die ganze Versammlung in der Schüssel &quot;A&quot;. </li><li> Halten Sie die Montage / Demontage-Werkzeug und die Folie von gegenüberliegenden Seiten mit einer Hand, sorgfältig schälen die A4-Mixer. Achten Sie darauf, nicht zu verkratzen das Array-Bereich. </li><li> Raschen Platzierung der Folie in das Rack in Färbung Gericht &quot;B&quot;. Von nun an sollte sich an der Luft minimiert, da die Cy5-Farbstoff ist empfindlich gegen Ozon. Waschen Sie nicht mehr als 8-Arrays zu einem Zeitpunkt. </li><li> Wash für 1 Minute unter Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit. </li><li> Füllen Färbung dish &quot;C&quot; mit vorgewärmten Waschpuffer 2. Die Objektträger und waschen für 1 Minute. </li><li> Sehr langsam entfernen Sie die Folie Rack von Färbung dish &quot;C&quot; zu Tröpfchen hinter auf der Folie links zu minimieren. </li><li> Trocknen Sie die Folie durch Spinnen für 2 Minuten. Wenn ein kompatibles Zentrifuge nicht verfügbar ist, Zentrifuge die Folie in einem 50-ml konische Röhre oder Schlag Argon darüber. </li><li> Die Objektträger in einer 50-ml konischen Rohr und füllen Sie ihn mit dem Edelgas Argon. Scan sofort zu signalisieren, zu vermeiden. Wir empfehlen die Verwendung des GenePix 4000B-Scanner von Molecular Devices. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Gute Qualität der Gesamt-RNA-Proben sollten produzieren nur zwei große Spitzen, wenn in einem Bioanalyzer für die Qualitätskontrolle laufen, entsprechend den 2 großen ribosomalen RNA-Spezies. Einige RNA-Abbau wird als ein Abstrich vor der ersten ribosomale RNA Peak zeigen. Erheblich beeinträchtigt, wird geringer Qualität RNA zeigen einen breiten Peak oder eine Reihe von Peaks bei niedrigen Retentionszeiten, während die 2 ribosomale RNA Gipfel sehr geringer Intensität oder nicht identifizierbare überhaupt sein wird. Beispiele für die 2100 Bioanalyzer Ausgang, siehe Abbildung 1. Die Expert 2100 Software berechnet eine RNA Integrity Number, oder RIN als eine quantitative Messung der RNA-Qualität. Hochwertige Proben mit RIN Werte größer als 9, sind offensichtlich am besten für Mikroarray-Anwendungen. Allerdings haben wir Proben mit RIN Werte so niedrig wie 5.2 in Erzeugung von Microarray-Daten von angemessener Qualität verwendet. Gute Qualität Arrays sollten High-Signal bei relativ niedrigen PMT Werte erzeugen. In unserem Experiment sind die meisten der Transkripte voraussichtlich auf ähnlichem Niveau in der experimentellen und Referenzprobe vorhanden; massive, breite Veränderungen in der Genexpression wird wahrscheinlich fehlt jede biologische Bedeutung. Daher sollten die meisten der Array suchen, anstatt grün oder rot, gelb. Gute Qualität Signale sollten auch in einem dynamischen Bereich, so dass das Signal Histogramme vollständig überlappen. Für Beispiele siehe Abb. 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel von vier RNA-Proben aus menschlichem Gehirn Tumorgewebe isoliert. RNA wurde unter Verwendung des Protokolls in 3.1.1 vorgestellt. Beispiel Qualität wurde anhand der 2100 Bioanalyzer auf einem RNA 6000-Chip wie in 3.1.3 beschrieben. Die Proben sind repräsentativ für 4 verschiedene RNA Qualitäten: A, sehr gute RNA-Qualität (RIN&gt; 9); B, partiell abgebauten RNA (RIN 5-6, beachten Sie die deutlich niedrigeren Peak für 28S rRNA); C, stark degradierte RNA (RIN &lt; 3); D, fast vollständig abgebaut RNA (RIN = 2). Wir haben erfolgreich Proben mit ähnlichen Eigenschaften wie oder besser als B (RIN&gt; 5,2) für nachgeschaltete Microarray-Anwendungen eingesetzt. Solide und offene Pfeilspitzen zeigen die Position der 18S und 28S rRNA Tierarten. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiele für Array von Bildern und Streudiagramme. A, ganze Dia-Vorschau und zeigt die vier Arrays in der 4X44K Agilent-Format; B, hochauflösende Scans von einem der Array-Bereiche zu beachten, dass keines der Signale (rot oder grün) überwiegt; C, Streudiagramm des Bildes in B, beachten Sie, dass die Signale vollständig überlappen und nicht mehr als 1x10 -6 Features sind bei Sättigung Intensität.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

Expression Profiling mit DNA Microarrays bietet eine einfache Lösung, um differentiell exprimierte Gene zwischen zwei biologischen Proben zu identifizieren. Erfolgreiche Expression Profiling Experimente erfordern qualitativ hochwertige RNA-Proben, robust Kennzeichnung und Hybridisierung. In unserer Erfahrung, bieten die kommerziellen Arrays und Kennzeichnung Kits von Agilent qualitativ hochwertige Daten zu einem vernünftigen Preis. Während Agilent bietet auch eigene Hybridisierung und Scannen Maschinen, favorisieren wir die Hybridisierung von Roche NimbleGen-und GenePix 4000B Microarray-Scanner von Molecular Devices. Beachten Sie, dass die Roche-NimbleGen Hybridisierung Einheit früher als MAUI Hybridisierung System bekannt. Nach der jüngsten Firmenübernahme von Roche haben die A4 Mischer eingestellt worden. Ab dem Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels, können sie immer noch durch andere Anbietern wie KREATECH Diagnostics (gefunden werden <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ; dieser Website bietet auch eine bequeme Array-Kompatibilität-Tool), aber langfristige Lieferfähigkeit ist ungewiss. Andere Hybridisierung Systeme zur Verfügung stehen (z. B. von Agilent), aber wenn kompatiblen Mixer zu finden für das Array verwendet werden, empfehlen wir die Roche-NimbleGen Systems für seine Qualität und Reproduzierbarkeit.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Microarray Expression Profiling des Nervensystems bietet eine leistungsstarke Ansatz zur Identifizierung von Gen-Aktivitäten in verschiedenen Stadien der Entwicklung, verschiedene physiologische oder pathologische Zustände, Ansprechen auf die Therapie und in der Regel keine Bedingung, dass experimentell ist 1 getestet. Expression Profiling von Nervengewebe erfordert die Isolierung von hochwertigen RNA, Amplifikation der isolierten RNA und Hybridisierung an DNA-Mikroarrays. In diesem Artikel beschreiben wir Protokolle für reproduzierbare Microarray-Experimente aus dem Gehirn Tumorgewebe 2. Wir werden von der Durchführung einer Qualitätskontrolle Analyse der isolierten RNA-Proben mit der Agilent 2100 Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot;-Technologie zu beginnen. Hochwertige RNA-Proben sind entscheidend für den Erfolg eines jeden Microarray-Experiment, und die 2100 Bioanalyzer bietet eine schnelle, quantitative Messung der Qualität der Proben. RNA-Proben werden dann verstärkt und gekennzeichnet durch die Durchführung der reversen Transkription zu erhalten cDNA, gefolgt von in vitro-Transkription in Gegenwart von markierten Nukleotiden an markierte cRNA produzieren. Durch die Verwendung einer Zwei-Farben-Labeling Kit, werden wir unsere experimentellen Probe mit Cy3-und eine Referenzprobe mit Cy5-Label. Beide Proben werden dann kombiniert und gekreuzt werden, um 4x44 K Agilent Arrays. Dual-Farb-Arrays bieten den Vorteil, dass ein direkter Vergleich zwischen zwei RNA-Proben, wodurch die Genauigkeit der Messungen, insbesondere für kleine Änderungen in Expression, weil die beiden RNA-Proben kompetitiv an einem einzigen Microarray hybridisiert sind. Die Arrays werden an den beiden entsprechenden Wellenlängen gescannt werden, und das Verhältnis von Cy3 zu Cy5-Signal für jede Funktion wird als eine direkte Messung der relativen Häufigkeit der entsprechenden mRNA verwendet werden. Diese Analyse identifiziert Gene, die in Reaktion auf die experimentellen Bedingungen getestet werden ausgedrückt.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Wir zeigen die Verwendung von DNA-Microarrays für die Expression Profiling des Nervensystems. Wir beschreiben RNA Qualitätskontrolle, Probe Kennzeichnung und Array-Hybridisierung und Scannen.

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K Aufrufe.  University of California, Davis. Wir zeigen die Verwendung von DNA-Microarrays für die Expression Profiling des Nervensystems. Wir beschreiben RNA Qualitätskontrolle, Probe Kennzeichnung und Array-Hybridisierung und Scannen.

Serie: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Forschung

Biologie

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...