InDevR erkennt NIH / NIAID U01AI070276 und R43AI077112 für die Finanzierung dieser Arbeit.

1. Probe-Amplifikation mit RT-PCR <ol><li> Auszug viraler RNA aus klinischem Material oder ein Virusisolat mit dem Qiagen MinElute Virus Spin Kit in Verbindung mit dem QIAcube automatisierte Nukleinsäure-Extraktion-Plattform. Extraktionen auf 200 ul Probe mit einer abschließenden Elutionsvolumen von 60 ul durchgeführt. Shop-Extrakte bei -70 ° C oder niedriger für die spätere Verwendung. </li><li> In einer Vorlage frei-Bereich bereiten die RT-PCR Master Mix auf Eis nach dem Protokoll des Herstellers. Zur Einarbeitung Biotin während der RT-PCR, mit einem biotinylierten dNTP-Gemisch anstelle des Herstellers dNTP-Mix. Die Kosten für die Verwendung eines biotinylierten dNTP Mischung weniger als $ 1 USD / Test. Alternative Methoden der Biotin-Einbau, wie die Verwendung eines biotinylierten Primer kann ebenfalls verwendet werden. Add Primermischungen in Endkonzentrationen von 1,0 uM für Flu A, 1,0 uM für Flu B und 0,14 pM für die interne Kontrolle. Die Grippe A Primer verstärkt die Matrix-Gen-Segment (1032 nt-Produkt) und die Flu B Primer verstärkt eine nicht-strukturelle Gen-Segment (811 nt-Produkt). Jeder FluChip Primer-Set enthält ein Primer mit einem 5 &#39;Phosphorylgruppe auf die Erzeugung von Einzelstrang-DNA durch enzymatische Verdauung mit Lambda-Exonuklease folgenden PCR erleichtern. Die resultierende einzelsträngige Produkt erfordert viel kürzer Hybridisierung Zeiten als die doppelsträngigen gleichwertig und verkürzt die gesamte Testzeit. Eine vorbereitete Mischung dieser Primer sowie die internen Kontroll-Template-RNA sind von InDevR an interessierte Wissenschaftler auf einer begrenzten Basis. </li><li> Kurz vortexen und verteilen 18 ul des Master-Mix in dünnwandigen PCR-Gefäße. </li><li> Transfer-Röhrchen auf Eis, um einen geeigneten Arbeitsplatz für die Vorlage hinaus, und fügen Sie 2 ul Vorlage zu jedem Reaktionsgefäß. </li><li> Transfer-PCR-Röhrchen zu einem Thermocycler, und führen Sie das folgende thermische Profil: reverse Transkription bei 50 ° C für 30 min, Enzym-Inaktivierung / Aktivierung bei 95 ° C für 15 min, 40 PCR-Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 min, und einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min. </li></ol> 2. Die Hybridisierung der RT-PCR-Produkte zu niedrigen Dichte Microarrays <ol><li> Um Einzelstrang-DNA für die Hybridisierung FluChip erzeugen, bereiten die enzymatische Verdauung Mischung durch die Kombination von 1,0 ul Lambda-Exonuklease Enzym, 2,2 ul der begleitenden Reaktionspuffer und 0,8 pl Nuklease-freies Wasser. Diese Beträge werden für eine einzelne Probe, sondern kann einfach die Gesamtzahl der Proben verdaut werden skaliert werden. Nehmen Sie Proben aus dem Thermocycler und fügen 4 ul der vorbereiteten Mischung in jede Reaktion auf die phosphorylierte Strang des PCR-Produkts zu verdauen. Zurück Proben dem Cycler entnommen und Programm der Thermocycler auf 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit 95 Grad Celsius für 10 Minuten auf enzymatische Verdauung und Wärme Fragmentierung Schritte vervollständigen. </li><li> Der Brauch Influenza-Microarrays verwendet werden, auf Aldehyd-funktionalisierten Glasträger durch angewandte Microarrays Inc. (Tempe, AZ) gedruckt. 5&#39;-Amino beendet Capture-Sequenzen sind mit einem optimierten Spotting-Puffer kombiniert und gedruckt in einer Endkonzentration von 20 uM (außer für die positive Kontrolle Sequenz, die zusätzlich eine 3&#39;-Biotin-Modifikation und wird in einer Endkonzentration von 500 nM spotted) . Eine berührungslose Spotting-Methode verwendet wird, mit einem optimalen Spot-Durchmesser von 300 um und Mitte zu Mitte Abstand von 700 um. </li><li> Entfernen Microarrays aus dem Ablagefach und gelten Einweg-Hybridisierung Brunnen rund um den Mikroarrays durch das Entfernen der Schutzfolie und drücken fest um gut Perimeter. </li><li> Die Objektträger in eine Wäsche bin mit 110 ml gereinigtem Wasser für 5 min vor der Hybridisierung waschen mit einem Orbitalschüttler bei 60-90 Umdrehungen pro Minute. Trocknen Sie die Array durch leichtes Berühren eines Gewebes Scheibenwischer an den Rand des Brunnens und damit Wasser auf Feuchtigkeit. </li><li> Kombinieren Sie 22 ul 2x Hybridisierungspuffer mit jedem der fragmentierten ssDNA Produkte und Pipette 40 ul der Hybridisierung Lösungen in der Microarray-Brunnen. </li><li> Lassen Sie die Objektträger in geschlossenen feuchten Kammer für 60 Minuten hybridisieren. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus der feuchten Kammer, kurz abspülen Arrays mit Waschpuffer D in eine Spülung Flasche, bevor Sie in die Folie Rack. Typischerweise wird die Spülung Volumen Waschpuffer D beträgt 2 ml pro Array. Legen Sie schieben Rack mit Dias in Wasch bin mit 110 ml Waschpuffer A. Ort bin auf Orbitalschüttler bei 60-90 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute. </li><li> Dia entfernen Rack von Waschpuffer A, kurz mit Waschpuffer D, Transfer Dia-Rack zu einem bin mit Waschpuffer B spülen und schütteln bei 60-90 rpm für 5 Minuten. </li><li> Vorsichtig trocken das Array auf jeder Folie und platzieren getrockneten Objektträger in feuchte Kammer in Vorbereitung ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Schritte. </li></ol> 3. ampliPHOX: Kennzeichnung hybridisiert Produkt-und Kalibrier-Chips mit ampliTAG <ol><li> Kombinieren<html> 10 ul ampliTAG, 20 ul 2x ampliTAG Puffer und 10 ul des gereinigten Wassers für jedes Array verarbeitet werden. Reagenzienvolumina einfach für die Gesamtzahl der Proben skaliert werden. Achten Sie darauf, genug Kennzeichnung Mischung erstellen kann für alle Probe-Arrays und Kalibrierung Arrays benötigt. Die Zahl der Kalibrierung Chips benötigt wird, hängt davon ab, ob Sie führen eine vollständige Kalibrierung (für ein neues Instrument oder neue Charge von Reagenzien), oder einfach nur ein Instrument zu überprüfen. Für eine vollständige Kalibrierung, sollte 3 Kalibrierung Chips gekennzeichnet werden, und für ein Reagenz zu überprüfen, nur eine einzige Kalibrierung Chip gekennzeichnet werden sollten. Bitte beachten Sie, dass vor der Kalibrierung Arrays gekennzeichnet sind, sollten sie durch die Vor-Hybridisierung Waschschritt, die zuvor für die Influenza-Arrays beschrieben wurde zu gehen. </li><li> Transfer-40 ul Label Mischung auf jedes Array und ermöglicht die Kennzeichnung Reaktion in einem geschlossenen feuchten Kammer für 5 Minuten gehen. </li><li> Sofort gründlich Arrays mit Waschpuffer D in eine Spülung Flasche, bevor Sie Dias in einer Diashow Rack. Transfer-Rack in bin mit 110 ml Waschpuffer C, und schütteln bei 60-90 rpm für 5 Minuten. </li><li> Mit einem zweiten Waschgang bin mit gereinigtem Wasser gefüllt, drei aufeinander folgende kurze Wasser taucht, um Salz zu entfernen. Trocknen Sie die Arrays durch leichtes Berühren eines Gewebes Scheibenwischer an den Rand der Wells. </li><li> Die Mikroarrays werden nun korrekt mit ampliTAG gekennzeichnet, und der Rest der ampliPHOX Nachweisverfahren durchgeführt werden kann. Photoaktivierung und Bildgebung von markierten Felder sollten innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen werden, und zusätzliche Arrays können in einer dunklen schiebeschachtel bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 4. ampliPHOX: Kalibrierung, Signalverstärkung und Imaging <ol><li> Schalten ampliPHOX Leser auf und sorgen für ampliVIEW Software ist bereit für die Photoaktivierung. </li><li> Bestimmen Sie die optimale Photoaktivierung Zeit mit Kalibrierung Chips. Neben der kurzen Einleitung, die folgt, ist dieses Verfahren auch im Detail in der ampliPHOX Operation Manual beschrieben. Die Kalibrierung Chips enthalten eine Reihe von Verdünnungen einer biotinylierten Kontrolle Sequenz, die genutzt werden, um die Sensitivität des Assays zu optimieren, mit dem Ziel der Maximierung der Anzahl der Zeilen der Kalibrierung Chip, der ein positives Signal von der Software bestimmt produzieren. </li><li> Entfernen ampliPHY von 4 ° C, lassen sich auf Raumtemperatur erwärmen und kurz vortexen zu mischen. Pipet 3 ul ampliPHY Enhancer in die ampliPHY Fläschchen, und gründlich vortexen für 10 Sekunden. </li><li> Gleichmäßig Transfer 40 ul ampliPHY Lösung in den Microarray gut mit den ampliTAG-markierten Array, so dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schließen Sie die ampliPHY Durchstechflasche zwischen einzelnen Anwendungen. Legen Sie die Microarray-Folie in die Photoaktivierung Bucht des ampliPHOX Reader. </li><li> Für die erste Kalibrierung Array, verwenden Sie die Standard-Photoaktivierung Mal in der &quot;Zeit&quot;-Box auf der linken Panel der Software, und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche &quot;Start&quot; um die Photoaktivierung starten. Einmal vollendet, entfernen Sie das Array und gründlich mit Wasser gereinigt, um überschüssige ampliPHY entfernen. Klare Polymerbildung auf einige der Punkte sollten jetzt sichtbar sein. </li><li> Lassen Sie die Polymer-Spots für 2 Minuten trocknen lassen, dann verteilen zwei Tropfen auf den Array ampliRED und ermöglichen Färbung für 2 Minuten ablaufen. </li><li> Als nächstes schnell Microarray gründlich mit gereinigtem Wasser und trocknen Sie mit einem Papiertaschentuch abwischen. </li><li> Legen Sie Microarray in der Imaging-Bucht des ampliPHOX Reader, und klicken Sie auf die &#39;Capture New Image &quot;-Taste in der Imaging Registerkarte. Sobald abgebildet, stellen Sie die Pflanzen und speichern das Bild. </li><li> In der Registerkarte Analyse, wählen Sie die Kalibrierung Chip Maske und der &#39;Auto Placement &quot;, um die Analyse zu starten. Die Software wird automatisch eine &quot;Zusammenfassung Record &#39;zeigt die quantifizierte Ergebnisse. Basierend auf diesen Ergebnissen wird die Photoaktivierung Zeit von 10 Sekunden für die zweite Kalibrierung Array eingestellt, und der Vorgang wiederholt. </li><li> Sobald die optimale Photoaktivierung Zeit ermittelt worden ist, kann die Probe Arrays mit den gleichen Signalverstärkung und Imaging-Protokoll für die Kalibrierung Arrays verwendet werden. </li><li> Sobald das Bild für die Probe Arrays erfasst, kann eine Maske für Ihre spezielle Array-Layout wie die Influenza Arraylayout hier beschriebenen created.The ampliVIEW Software ist in der Lage, die automatisierte Bildanalyse und Erzeugung Influenza Subtypen Ergebnisse für jede Probe. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung des ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis-Methode. (A) Biotinylated Ziel-DNA ist auf jeden Spot in dem Array hybridisiert und (B) mit ampliTAG gekennzeichnet. (C) ampliPHY Lösung wird dann hinzugefügt, und (D) dem Licht ausgesetzt, um zu sehen Polymer Flecken bilden. (E) Das Polymer Flecken gebildet werden anschließend mit einem ungiftigen Farbstoff, um den Kontrast zu verbessern gefärbt. NHALT &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. (A) Influenza low density Microarray-Layout. Sequenzen 1-7 und 10-13 Ziel Influenza A und Sequenzen 8, 9 Ziel Influenza B. (B) ampliPHOX und (C) Fluoreszenz-Aufnahmen von einem 2009 neuartige H1N1 (&quot;Schweinegrippe&quot;) Probe zeigt die gleiche Erkennungsmuster von beiden Methoden. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Von links nach rechts, Vertreter ampliPHOX Bilder für Influenza A H3N2, H1N1 human-Ursprung, 2009 neuartige H1N1 (Schweinegrippe-Ursprungs) und eine negative Probe. Alle 3 Subtypen zeigen visuell bestimmte Muster auf dem Array. Beachten Sie in den negativen, dass nur die MS2 internen Kontrollsystems zu sehen ist, wurde unter Angabe der RT-PCR-Amplifikation nicht gehemmt.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

Alle Autoren sind Mitarbeiter von InDevR, Inc., eine gemeinnützige Einrichtung. InDevR ist die Vermarktung der ampliPHOX Technologie beschrieben wird.

Die ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis hier vorgestellte Technologie ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zu einfarbigen Fluoreszenzdetektion für geringere Dichte Microarray-Anwendungen. Schematisch in Abbildung 1 dargestellt, ist der Nachweis grundsätzlich auf die Verwendung eines Photoinitiators Label (1B) basiert. In der Gegenwart eines Monomer-haltigen Lösung (1C), bewirkt Belichtung der Photoinitiator (ampliTAG), um eine Polymerisationsreaktion nur in gekennzeichneten Bereichen (1D...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenz / Ausrüstung </th><th> Hersteller </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Virus Spin Kit </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> Einzel 60 ul Elutionspuffer </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> fakultativ </td></tr><tr><td> ABI 9800 Schnelle Thermal Cycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> kit dNTPs nicht verwendet </td></tr><tr><td> 2x Spotting-Puffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda-Exonuklease </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip Primermischung </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> noch nicht verfügbar zum Verkauf </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Madell Technologie </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Wash Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Wash Racks </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2x Hybridisierungspuffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Calibration Chips </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Waschpuffer AD </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY Enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA-Mikroarrays wurden als ein mächtiges Werkzeug für den Erregernachweis entstanden. 1-5 So viele Beispiele für die Fähigkeit, Typ und Subtyp Influenza-Virus nachgewiesen wurden. 6-11 Die Identifizierung und Subtypisierung von Influenza auf DNA-Mikroarrays wurde Anwendungen sowohl im öffentlichen Gesundheit und die Klinik für die Früherkennung, die ein rasches Eingreifen und die Minimierung der Auswirkungen einer Influenza-Pandemie. Traditionelle Fluoreszenz ist derzeit die am häufigsten verwendeten Microarray-Nachweisverfahren. Doch wie Microarray-Technologie schreitet in Richtung klinische Anwendung, 1 ersetzt teure Instrumente mit geringen Kosten-Detection-Technologie präsentiert ähnlichen Leistungsmerkmalen zur Fluoreszenz wird Microarray-Assays attraktiver und kostengünstiger. Die ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie ist für die Forschung Anwendungen gedacht und hat eine Nachweisgrenze innerhalb einer Größenordnung von traditionellen Fluoreszenz 11, mit einem Vorteil wird eine ungefähre zehnfach niedrigeren Gerätekosten im Vergleich zum konfokalen Mikroarray-Scanner für Fluoreszenz-Mikroarray erforderlich Erkennung. Ein weiterer Vorteil ist die kompakte Größe des Instruments, die für Portabilität und Flexibilität ermöglicht, im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Instrumente. Da die Polymerisation Technologie ist nicht als inhärent linear als Fluoreszenz-Detektion ist es jedoch am besten für geringere Dichte Microarray-Anwendungen, bei denen eine Ja / Nein Antwort auf das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz gewünscht wird, wie für den Erregernachweis Arrays geeignet. Derzeit die maximale Spotdichte mit ampliPHOX Erkennung ~ 1800 Punkte / array. Wegen der Spotdichte Einschränkungen sind höhere Dichte Microarrays nicht geeignet für ampliPHOX Erkennung. Hier präsentieren wir ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie als eine Methode der Verstärkung von Signalen auf eine geringe Dichte Microarray für die Detektion und Charakterisierung von Influenza-Viren (FluChip) entwickelt. Obwohl dieses Protokoll nutzt die FluChip (ein DNA-Microarray) als eine spezifische Anwendung des ampliPHOX-Erkennung, eine Microarray Einbeziehung biotinylierten Ziel kann beschriftet und in ähnlicher Weise erkannt werden. Die Microarray-Design und Biotinylierung des Ziels zu erfassen liegen in der Verantwortung des Nutzers. Sobald die biotinylierten Ziel ist auf dem Array erfasst wurde, kann ampliPHOX Erkennung durch erste Tagging durchgeführt werden das Array mit einem Streptavidin-label-Konjugat (ampliTAG). Nach Belichtung mit dem ampliPHOX Reader Instrument, Polymerisation einer Monomerlösung (ampliPHY) tritt nur in Regionen mit ampliTAG-markierten Ziele. Das gebildete Polymer kann anschließend mit einem ungiftigen Lösung visuellen Kontrast zu verbessern, indem Abbildung und Analyse mit einem einfachen Software-Paket (ampliVIEW) gefolgt gefärbt werden. Die gesamte FluChip Assay von un-extrahierten Probe bis zum Ergebnis kann in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, und die ampliPHOX Erkennung oben beschriebenen Schritte können in ca. 30 min abgeschlossen sein.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  InDevR Inc.. ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

Serie: ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...