Der Autor dankt Barbara Berli für die Bereitstellung von beispielsweise Daten und die gnädige Finanzierung des Canadian Wildlife Federation.

1. Capture and Akklimatisierung <ol><li> Mit einem astrein net, sammeln einzelne Fische aus ihrem Vorratsbehälter. Minimieren Sie erfassen, vermeiden Sammeln mehrerer Fische und halten nicht Fische, die länger als ein paar Sekunden im Netz, da diese Faktoren Stress erhöhen können. Stress kann sich auf Schwimmen Leistung. </li><li> Legen Sie den Fisch entweder in einem Transfer-Tank mit Betäubung oder direkt an den baden-Tunnel Respirometer (&quot;schwimmen Tunnel&quot;). Wenn Fische werden betäubt werden, entweder Tricaine Methansulfonat (MS222) oder Nelkenöl verwendet werden kann. Acceptable Konzentrationen hängt von vielen Faktoren ab, darunter die Empfindlichkeit der Art und der Temperatur abhängig, sondern typischerweise im Bereich von 10-100 mg / L für beide Anästhetika 1,2. Die Betäubung Konzentration sollte induzieren Stufe 3 Anästhesie (dh reagiert auf äußere Reize) und ermöglichen eine schnelle Erholung (dh Sekunden). Bei der Verwendung von MS222 im Süßwasser, sollte Natriumbicarbonat zu gleichen Teilen (Masse) als Puffer verwendet werden. Ohne Puffer wird MS222 erheblich reduzieren pH-Wert und niedrigen pH-Wert kann gill Gewebe schädigen. Pufferung ist nicht in Meerwasser notwendig, da es ausreichend Pufferkapazität enthält. </li><li> Narkotisierten Fisch kann sexed, gemessen an der Masse und Länge, und da ein flüchtiger externe Prüfung ihres Zustandes. Länge kann als Gesamtlänge (TL), Gabellänge (FL) oder Körperlänge (BL) entnommen werden. Diese unterschiedlichen Metriken sind in der Regel nach den üblichen Richtlinien angewendet, Arten Morphologie (z. B. keine gespaltene fin) oder Fisch Bedingung (zB Schwanzflosse abgenutzt). </li><li> Beide betäubt und nicht narkotisierten Fische sollten in der baden-Tunnel eingeführt so schnell wie möglich und in fließendem Wasser, da dies Verwertung zu erleichtern wird. Der Durchfluss wird in der Regel so eingestellt, dass Fisch in der Lage, auf dem Boden ruhen, während kaum schwimmen. Ein Beispiel-Rate für Erwachsene Rotlachs beträgt 0,3 BL / s. </li><li> Fische müssen in der baden-Tunnel zu akklimatisieren gelassen werden. Akklimatisierung Zeitraum kann zu traditionellen Zeiträume (zB 12 Stunden) oder mit denen in den meisten aktuellen Studien, die so kurz wie 30 min kann eingestellt werden. Um zu bestimmen, eine ideale Akklimatisierung für einen bestimmten Fisch, die Zeit bis zum erreichen einer stabilen, idealerweise niedrigen Stoffwechselrate verwendet werden (ausführliche nächsten Abschnitt). </li></ol> 2. Messen Metabolic Preise <ol><li> Änderungen in Sauerstoff innerhalb der baden-Tunnel soll über die Dauer des Swim Test (s) aufgezeichnet werden. Oxygen Sonden können direkt in die baden-Tunnel abgedichtet werden, aber es muss zunächst festgestellt werden, ob Wasser über die Sonde die Funktion der Sonde beeinflusst werden. Wenn die Sonde mit Wasser Geschwindigkeiten, die während des Tests auftreten können, betroffen ist, wird die Sonde muss in einer eigenen Kammer außerhalb des Tunnels angebracht werden und wird mit Tunnel Wasser durch eine Pumpe. </li><li> So füllen Sie Sauerstoff und mindern Abfallaufkommen, wird der baden-Tunnel wahrscheinlich müssen regelmäßig gespült werden. Sauerstoff-Sättigung sollte nicht gestattet, weniger als 70% für die meisten Arten fallen wie Schwimmen Leistung kann reduziert werden oder es kann eine Verschiebung zu den anaeroben Stoffwechsel werden. Flushing Tunnel Wasser kann auch dazu beitragen, etwaige Erhöhungen der Wassertemperatur, jedoch Wassertemperatur sollte konstant gehalten werden durch die Kopplung der baden-Tunnel zu einem Kühler. Veränderungen in der Temperatur beeinflussen den Stoffwechsel. </li><li> Routine und maximale metabolische Rate, abgekürzt &quot;RMR&quot; und &quot;MMR&quot;, sind in der Regel bestimmt (Abbildung 1A). Diese Preise können in Volumen (V o 2) oder Masse (M o 2) von Sauerstoff pro Masse ausgedrückt werden, pro Zeiteinheit, zB mg O 2 / kg / Std. Der Unterschied zwischen den beiden Sätzen werden können, um den &quot;Spielraum für Aktivität&quot; zu bekommen. Die &quot;Sauerstoffschuld&quot; folgende Übung, die so genannte &quot;Excess Post-Übung Sauerstoffverbrauch&quot; (EPOC), kann auch bestimmt werden und ist gleich dem Sauerstoff während der post-exercise Rückkehr zu RMR erforderlich. </li></ol><ol><li> Hinweis: viele Sauerstoffsonden und ihre Leistung automatisch bereitstellen wird temperatur-korrigiert Änderungen in gelöstem Sauerstoff. Diejenigen, die nicht müssen korrigiert werden. Darüber hinaus werden einige Werte müssen korrigiert werden, wenn Messungen in Kochsalzlösung Bedingungen durchgeführt wurden. </li></ol> Schwimmen Performance-Messung Eine Vielzahl von Baden Performance Fähigkeiten können in einem Bad Tunnel beurteilt werden. Die gängigste Methode zum Schwimmen Leistung charakterisieren wird durch die Dauer, für die es 3 aufrechterhalten werden kann. Je langsamer die Geschwindigkeit, desto länger aufrechterhalten werden kann und umgekehrt. Geschwindigkeiten werden im Allgemeinen als &quot;Burst&quot; bezeichnet, &quot;verlängerte&quot; oder &quot;nachhaltig&quot;, die Dauer in Sekunden, Minuten bis Stunden (max = 200 min) und Stunden und darüber hinaus (&gt; 200 min) entsprechen jeweils. Um zu bestimmen, diese Geschwindigkeiten sind Fische, benutzerdefinierte &quot;Schritte&quot;, bestehend aus &#39;height&#39;, dh Wasserfluss zu erhöhen, und &quot;Länge&quot;, dh Schritt Dauer ausgesetzt. Maximierung der Sprunghöhe und der Minimierung Schrittlänge wird die größte Berstdrehzahl erfassen, während sie umgekehrt wird fangen die größten nachhaltigen Geschwindigkeit. In SchrittTests ist der traditionelle Weg, um die maximale Geschwindigkeit erreicht Bericht gleich der Geschwindigkeit des letzten vollständig abgeschlossenen Schritt sowie die zeitliche Anteil der letzte, unvollendete Schritt (Abbildung 1A). Burst Schwimmen Leistungsbeurteilung <ol><li> Zur Erfassung Burst Schwimmen oder Sprint Fähigkeit, nach Eingewöhnung, bringen die Strömungsgeschwindigkeit zu einem geschätzten Maximum (z. B. zweimal U crit, siehe unten), und zu motivieren, die Fische zu schwimmen. Fische sollten auf der Rückseite der Kammer ruhen, wie die Strömungsgeschwindigkeit stark erhöht wird. Fische können müssen motiviert werden, schwimmen. Motivation kann mechanisch (zB Touch) oder elektrisch (z. B. eine kleine Gebühr angewandt, um einen Schock Gitter auf der Rückseite des baden-Tunnel). Obwohl nicht ausdrücklich ein Test der Burst Fähigkeit, können die Fische auch eine &quot;konstante Beschleunigung test &#39;(CAT-oder U-AV), bestehend aus mehreren Schritten von kurzer Dauer (zB 1 min) 4,5 gegeben werden. </li><li> Notieren Sie sich die Dauer des Schwimmens. Die Anzahl der einzelnen platzen und ihren Abstand kann auch 6 aufgezeichnet werden. Die Geschwindigkeit kann da als die maximale erreicht oder nach der Gleichung in Abbildung 1A berechnet werden. Längerer und nachhaltige Schwimmen Leistungsbeurteilung Die häufigste Maßnahme zur längeren oder dauerhaften Schwimmkenntnisse Schätzung wird als &quot;kritisch Schwimmen Leistung&quot; (U krit) bezeichnet. Schritt Länge für U crit ist traditionell bei 20 min eingestellt, obwohl auch kürzere Zeiten wie 10 min ebenfalls gebraucht worden sein. Als Faustregel gilt, dass mindestens zehn Schritte vor sollte Müdigkeit, die in langwierigen Tests, z. B.&gt; 3 Std. / Fisch Ergebnis ergriffen werden können. Zur Verkürzung der U crit testen, können die ersten sieben Schritte abgekürzt werden 5 min (der Test ist dann als &#39;Ramp-U crit). </li></ol><ol><li> Nach Akklimatisierung und / oder eine Praxis zu schwimmen, zu erhöhen Strömungsgeschwindigkeit nach Größe Schritt. </li><li> Um die entsprechende Stufenhöhe für U crit, wird es wahrscheinlich notwendig sein, U crit für eine Probe des Fisches zu prüfenden schätzen. Dies kann durch Verwendung der Literatur Werte erreicht werden. Alternativ können die Fische eine &quot;Praxis schwimmen&quot; nach der Einführung des Tunnels gegeben werden. Dafür geben Fisch kurz, Benutzer-definierten Schritten, bis die Müdigkeit. Verwenden Sie die Endgeschwindigkeit als eine frühe Schätzung der U crit erreicht. Passen Sie Schritt Größe (Höhe und Länge) für jeden Fisch. </li><li> Um zu testen, Regenerationsfähigkeit oder bestimmen individuelle Variation in der Leistung, können die Fische ein zweites Schwimmen Test nach einer Erholungsphase 7-9 gegeben werden. </li><li> Fische können auch in Schulen erprobt werden, obwohl Fisch zu Müdigkeit neigen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während des Tests, die als problematisch für die Entfernung aus dem Tunnel und beseitigen kann die Fähigkeit zur Sauerstoffaufnahme zu messen. </li><li> Sobald müde, Fische sollten sich erholen oder unmittelbar für die Gewebeentnahme entfernt. Mehrere Performance-Metriken im Zusammenhang mit Schwimmen kann während des Tests oder nach der Verwendung von Video-Analyse gesammelt werden (Abbildung 1 C, D). </li><li> Zur Messung Luftwechselrate und Schwanz Schwebungsfrequenz, die Kiemendeckels Pumprate und die Anzahl der Schwanz schlägt sollten über einen Zeitraum von mehreren Sekunden (Abbildung 1B) 10,11 abgetastet werden. </li><li> Zur Messung Schwanz schlagen Amplitude, kann die maximale Auslenkung der Schwanzflosse gemessen (Abbildung 1B) werden 12. </li><li> Nach der Prüfung können die Fische getötet, da ein Post-Mortem-Untersuchung und Gewebe gesammelt, um Hämatokrit (gepackten roten Zellvolumens), Stress-Hormon-Konzentrationen, Muskel-Energie speichert (z. B. Phosphokreatin, Glykogen), Enzym-Aktivitäten (zB Laktat-Dehydrogenase, Acetylcholinesterase bestimmen ) oder andere physiologische Parameter. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2572/2572fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. A) Ein Beispiel für Ramp-U crit Test gegeben, um eine juvenile Salmoniden, hob einer Brüterei Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss), 6,3 cm Körperlänge (BL) und 3,5 g in Masse. Der Test wurde in einem 12 L modifizierten Brett-type Respirometer (; Loligo Systems, Dänemark durchgeführt <a href="http://www.loligosystems.com/">www.loligosystems.com</a> ). Routine und maximale metabolische Raten wurden als Steigung (mg / h) x Volumen (L) / Fisch (kg) berechnet und wurden 198 und 961 mg O 2 / kg / h bzw. (Raum für Aktivität = 4,84). Diese Sätze stehen im Einklang mit den vom Brett für jugendliche Sockeye (O. nerka) 13 berichtet. Hinweis: für die Sauerstoffaufnahme Berechnungen wird das Volumen des Wassers gleich der Respirometer Volumen kleiner Fisch Volumen. Das Kreuz zeigt an dem Punkt, wo die Fische weigerte sich, weiter zu schwimmen und wo U crit berechnet wurde. B) Rute Schwebungsfrequenz Werte wurden über 10 s sechsmal aufgezeichnet; Schwanz schlagen Amplitudenwerte wurden dreimal aufgenommen; dargestellten Wertesind Mittelwert ± SEM. C) Eine vergrößerte Seitenansicht und D) Draufsicht auf die Fische schwimmen im Schwimmen Kammer. D) zeigt die Fische durch EthoVision Software (Noldus, Niederlande verfolgt; <a href="http://www.noldus.com/">www.noldus.com</a> ). Abkürzungen: U crit = kritische Schwimmen Geschwindigkeit; U f = Geschwindigkeit des letzten vollständig abgeschlossenen Schritt, U s = Schrittgeschwindigkeit, t f = Zeit für letzte Schritt verbrachte, t s = Schritt Zeit.

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	<li>Anderson, W. G., McKinley, R. S., Colavecchia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+rainbow+trout+and+its+effects+on+swimming+performance.">The use of clove oil as an anesthetic for rainbow trout and its effects on swimming performance.</a> North Am. J. Fish Manage. 17, 301-307 (1997).</li><li>Cho, G. K., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+tricaine+methanesulphonate+(MS222)+and+clove+oil+anaesthesia+effects+on+the+physiology+of+juvenile+chinook+salmon+Oncorhynchus+tshawytscha+(Walbaum).">Comparison of tricaine methanesulphonate (MS222) and clove oil anaesthesia effects on the physiology of juvenile chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha (Walbaum).</a> Aquacult. Res. 31, 537-546 (2000).</li><li>Beamish, F. 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Biol. 207, 2979-2990 (2004).</li><li>Marras, S., Claireaux, G., McKenzie, D. J., Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+and+repeatability+in+aerobic+and+anaerobic+swimming+performance+of+European+sea+bass,+Dicentrarchus+labrax.">Individual variation and repeatability in aerobic and anaerobic swimming performance of European sea bass, Dicentrarchus labrax.</a> J. Exp. Biol. 213, 26-32 (2010).</li><li>Kolok, A. S., Plaisance, E. P., Abdelghani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+in+the+swimming+performance+of+fishes:+an+overlooked+source+of+variation+in+toxicity+studies.">Individual variation in the swimming performance of fishes: an overlooked source of variation in toxicity studies.</a> Environ. Toxicol. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+swimming,+recovery+and+repeat+swimming+performance+of+mature+sockeye+salmon+Oncorhynchus+nerka+exposed+to+moderate+hypoxia+and+pentachlorophenol.">Prolonged swimming, recovery and repeat swimming performance of mature sockeye salmon Oncorhynchus nerka exposed to moderate hypoxia and pentachlorophenol.</a> J. Exp. Biol. 201, 2183-2193 (1998).</li><li>Flammang, B. E., Lauder, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speed-dependent+intrinsic+caudal+fin+muscle+recruitment+during+steady+swimming+in+bluegill+sunfish,+Lepomis+macrochirus.">Speed-dependent intrinsic caudal fin muscle recruitment during steady swimming in bluegill sunfish, Lepomis macrochirus.</a> J. Exp. Biol. 211, 587-598 (2008).</li><li>Brett, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatigue+is+a+behavioural+response+in+respirometer+confined+smallmouth+bass.">Fatigue is a behavioural response in respirometer confined smallmouth bass.</a> J. Fish Biol. 68, 1742-1755 (2006).</li></ol>

In einer natürlichen Umgebung, hängen Verhaltensweisen wie Raubtier Flucht und Migration auf die Möglichkeit, an bestimmten Intensitäten für verschiedene Zeiten zu schwimmen. In einer Testumgebung, schwimmen Tunnel Respirometer und trat steigt in Geschwindigkeit kann verwendet werden, um die Fähigkeit von Fischen, zahlreiche Verhaltensweisen führen zu schätzen. Maßnahmen der metabolischen Rate und andere Gewebe-Ebene Assessments (wie Lactat-Produktion) können mit Swim-Tests einbezogen werden, um festzustellen, physiologischen Mechanismen, die verschiedene Swimming-Modi. Swim Tunnel-Design stark beeinflussen können schwimmen Leistung. Oder Blazka 14-Typen - Es gibt verschiedene Arten von Tunneln eingesetzt schwimmen schwimmen Performance zu bestimmen, sind die meisten entweder als Brett 13 charakterisiert. Bei beiden Design, sind wichtige Überlegungen der &quot;Gleichmäßigkeit&quot; der Wasserfluss (wie geradlinig ist), die maximale Strömungsgeschwindigkeit und die Länge der Kammer schwimmen. Ebenheit ist wichtig, weil Fische instinktiv finden und schwimmen in Low-Flow-Bereiche, um Aufwand zu minimieren. Hohes Potenzial Durchflussmenge kann notwendig sein, platzte schwimmen können oder schnell schwimmen Arten (zB Thunfisch) zu testen. Swim Kammer Länge kann sehr aussagekräftig, da in den Kammern der kleinen Länge, dh Fisch Länge&gt; 10% der Kammer Länge kann Fisch nicht in der Lage, alle schwimmen Modi nutzen. Insbesondere kann Röhrchen schränken die Fähigkeit von Fischen, um den Übergang von einem stationären zum Schwimmen Tor unsicher, dh zu platzen und die Küste schwimmen. Daher können Fische zu stoppen Schwimmen in etwa der gleichen Geschwindigkeit, unabhängig von der Schrittlänge und U crit kann analog zu &quot;Gate Eckdrehzahl &#39;15. Alle schwimmen Tunnel müssen kalibriert mit Hilfe von Geräten wie Durchfluss-Sonden oder Particle Imaging Velocimetry (PIV) Ausrüstung. Idealerweise schwimmen Tunnel wird geradlinig flow haben, aber wenn Fische gefunden werden, um eine Fläche für ihre schwimmen Geschwindigkeit kann auf lokale Unterschiede im Fluss angepasst werden.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.argent-labs.com">www.argent-labs.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Clove oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacy or <a href="http://www.sigmaaldrich.com">www.sigmaaldrich.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Swim tunnel respirometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made or <a href="http://www.loligosystems.com">www.loligosystems.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required</td>
</tr>
<tr>
<td>High speed cameras</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Numerous sources</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Video capture card</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Numerous sources</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Behaviour analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.noldus.com">www.noldus.com</a> <a href="http://www.cleversysinc.com">www.cleversysinc.com</a> <a href="http://www.loligosystems.com">www.loligosystems.com</a> <a hre</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

swimming performance assessment in fishes

Schwimmen Leistungstests der Fische wurden integraler Bestandteil Studien von Muskel-Energetik, Schwimmen Mechanik, Gasaustausch, kardiale Physiologie, Krankheiten, Umweltverschmutzung, Hypoxie und Temperatur. Dieser Beitrag beschreibt ein flexibles Protokoll für Fische schwimmen Leistung mit Hilfe von Geräten, in denen Wasser-Geschwindigkeit gesteuert werden kann beurteilen. Das Protokoll umfasst eine bis mehrere trat steigt in Strömungsgeschwindigkeit, die dazu bestimmt zu fischen, um Müdigkeit verursachen. Schritt Geschwindigkeiten und deren Dauer können zum Schwimmen Fähigkeiten der verschiedenen physiologischen und ökologischen Bedeutung zu erfassen. Am häufigsten Schrittweite eingestellt, um kritische Schwimmen Geschwindigkeit (U krit), die dazu bestimmt ein Maximum an nachhaltiger Schwimmen Fähigkeit zu erfassen ist zu bestimmen. Traditionell diesem Test hat von etwa zehn Schritten zu je 20 min Dauer bestand. Allerdings sind nur wenige Schritte von kürzerer Dauer (zB 1 min) zunehmend genutzt, um die Beschleunigung Fähigkeit oder Burst Schwimmen Performance Capture. Unabhängig davon, Schrittweite kann schwimmen Tests im Laufe der Zeit wiederholt werden, um individuelle Variation und Regenerationsfähigkeit zu messen. Endpunkte im Zusammenhang mit solchen als Maß der metabolischen Rate, fin Einsatz-, Lüftungs-Rate und des Verhaltens, wie der Abstand zwischen Fischschwärmen schwimmen, sind oft vor, während und nach dem Schwimmen Tests enthalten. Angesichts der Vielfalt der Fischarten, die Zahl der unerforschte Fragestellungen und die Bedeutung der vielen Arten, um globale Ökologie und wirtschaftliche Gesundheit, werden Studien an Fischen schwimmen Leistung wie vor beliebt und von unschätzbarem Wert für die absehbare Zukunft.

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Swimming Performance Assessment in Fishes

Das Leben der Mehrheit der Fische sind am Schwimmen ausgesagt. Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Erfassung einer Reihe von Schwimm-Modi zur Verfügung, um individuelle und Fischschwärmen und beinhaltet Metriken mit Swimming-Physiologie und Verhalten assoziiert.

Schwimmen Performance Assessment in Fische

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.3K Aufrufe.  University of Alberta. Das Leben der Mehrheit der Fische sind am Schwimmen ausgesagt. Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Erfassung einer Reihe von Schwimm-Modi zur Verfügung, um individuelle und Fischschwärmen und beinhaltet Metriken mit Swimming-Physiologie und Verhalten assoziiert.

Serie: Swimming Performance Assessment in Fishes

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Forschung

Biologie

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders such as diabetes and cardiovascular disease 1-3. An important topic of research into these associated health problems involves the role of endurance exercise as a beneficial intervention.
Exercise training is an inexpensive, non-invasive intervention with several beneficial results, including reduction in excess body fat 4, increased insulin sensitivity in skeletal muscle 5, increased anti-inflammatory and antioxidative responses 6, and improved contractile capacity in cardiomyocytes 7. Low intensity exercise is known to increase mitochondrial activity and biogenesis in humans 8 and mice, with the transcriptional coactivator PGC1-&alpha; as an important intermediate 9,10. 
Despite the importance of exercise as a tool for combating several important age-related diseases, extensive longitudinal genetic studies have been impeded by the lack of an endurance training protocol for a short-lived genetic model species. The variety of genetic tools available for use with Drosophila, together with its short lifespan and inexpensive maintenance, make it an appealing model for further study of these genetic mechanisms. With this in mind we have developed a novel apparatus, known as the Power Tower, for large scale exercise-training in Drosophila melanogaster 11. The Power Tower utilizes the flies' instinctive negative geotaxis behavior to repetitively induce rapid climbing. Each time the machine lifts, then drops, the platform of flies, the flies are induced to climb. Flies continue to respond as long as the machine is in operation or until they become too fatigued to respond. Thus, the researcher can use this machine to provide simultaneous training to large numbers of age-matched and genetically identical flies. Additionally, we describe associated assays useful to track longitudinal progress of fly cohorts during training.

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

We describe the first endurance training protocol for an important genetic model species, Drosophila melanogaster, and outline several assays to chart improvements in mobility following training.

Ausdauertraining Protokoll und Längs-Performance-Assays für Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...