Diese Forschung wird von der National Science Foundation verliehen JOD (OCE-0623475), SPC (OCE-0623534 und 0727544) und JHC (OCE-0727587 und OCE-0623508) unterstützt und durch das Office of Naval Research zur JHC ausgezeichnet ( N000140810654). KK wird durch die Postdoctoral Scholar Program an der Woods Hole Oceanographic Institution, mit der Finanzierung durch die Devonshire-Stiftung zur Verfügung gestellt unterstützt.

<ol><li> Zu Beginn dieses Verfahren stellen wir sicher, dass alle SCUVA Komponenten ausreichend mit Batteriestrom versorgt, Tonband (für die High-Definition-oder HD-Video-Kamera), und die Funktion haben, richtig. Je nach fließt gemessen werden soll, wählen Sie Video-Kamera-Auflösung und Bildraten, die besten Ergebnisse für den digitalen Particle Image Velocimetry (DPIV) zu ergeben. 1,2 </li><li> Bereiten Sie den Laser und Kamera-Gehäuse für die Nutzung durch die Reinigung der O-Ring-Nuten und O-Ringe mit einem sauberen Handtuch oder wischen. Spread-Hersteller mitgelieferten O-Ring Fett gleichmäßig auf die O-Ringe und ersetzen Sie sie in das Gehäuse Nuten. Darüber hinaus reinigen Sie die Laser und Kamera-Gehäuse Öffnungen auf Laser-Blatt Verformung und Markierungen auf dem Kameragehäuse Linse zu verhindern. </li><li> Überprüfen Sie den O-Ring-Dichtungen, indem beide leer Gehäuse in einer Wanne voll Wasser. Gewichtete Objekte müssen auf der Oberseite des Gehäuse zu versenken sie gestellt werden, da die Gehäuse leer zu schweben. Nach 5 bis 10 Minuten, entfernen Sie das Gehäuse aus der Wanne und abtrocknen ter draußen. Prüfen Sie, ob es keine Feuchtigkeit in den Gehäusen. Sehen Sie sich auch mit Einweg-, Papier Feuchtigkeit Streifen während der Druckprüfung, um anzuzeigen, ob es Feuchtigkeit im Gehäuse nach dem Test. </li><li> Nach den Gehäusen der Druck Test bestehen, platzieren SCUVA Komponenten im Inneren der Gehäuse. </li><li> Bringen Sie Hochdruckentladungslampen (HID) Licht Schoten mit dem Kameragehäuse. Stellen Sie sicher, dass die Lichter so ausgerichtet, dass sie den Bereich direkt vor der Kamera und Operator beleuchten sind, und nicht mit der Aufrechterhaltung der Griff Griffe und Bedienung der Kamera steuert stören. </li><li> In einer dunklen Umgebung, sicherzustellen, dass der Laserstrahl korrekt ausgerichtet ist bezogen auf die optische Linse im Laser-Gehäuse eingebaut. Wenn richtig ausgerichtet, wird der Laser / Objektiv-Kombination eine vertikale Platte des Lichts, das senkrecht zur Kameragehäuse ist. Aus Sicherheitsgründen verwenden Sie einen temperaturempfindlichen Blatt Papier, um Laser-Blatt-Ausrichtung zu bestimmen. </li&gt; <li> Mit SCUVA Anlagen und die starren, ausfahrbaren Arm, schließen Sie den Laser-Gehäuse und die Kamera-Gehäuse zueinander. Stellen Sie sicher, dass das Gehäuse fest verbunden sind und dass das Gehäuse nicht in Bezug zueinander drehen. Es ist wichtig, dass die Laser-Folie orientiert bleibt senkrecht zur Kamera Sichtfeld während der Messung. </li><li> Aufgrund der derzeitigen Fähigkeiten von SCUVA, kann die Messung Tauchgänge nur in low-light Orten oder nachts durchgeführt werden, um natürliches Licht Interferenzen mit dem Laser-Blatt zu verhindern. Daher empfehlen wir warten, bis der Dämmerung oder später vor dem Eintritt in das Wasser. </li><li> Schalten Sie die Kamera-Gehäuse, bevor Sie ins Wasser gehen. Das Kameragehäuse hat einen eingebauten elektronischen Feuchtigkeitssensor, dass die visuelle Warnungen bietet (blinkende LED) im Falle von Feuchtigkeit in das Kameragehäuse. Der Sensor funktioniert nur, wenn das Kameragehäuse auf. </li><li> Tauchen SCUVA in Wasser und befestigen Sie das Gerät, um sich miteiner Linie. Sobald der Apparat befestigt, lassen SCUVA den Auftrieb Eigenschaften des Gerätes bestimmen. Je nach Auftriebscharakteristik legen Auftriebsschaum oder Bleigewichte an einem oder beiden Gehäusen neutralen Auftrieb zu gewährleisten und zu verhindern Drehung der Apparatur im Wasser. </li><li> Als nächstes auf der Laser-Schalter und halten Sie das Gerät stationär. Positionieren Sie den Laser mit dem ausfahrbaren Arm hinreichend weit von dem Taucher, Messung von diver-induzierte Ströme zu minimieren. Alle Messungen der Taucher-induzierte Ströme in der Nähe des Ziels vorstellen Fehler und sind nicht für die anschließende Analyse verwendet. Stellen Sie die Kamera-Zoom, bis das Sichtfeld Rahmen der Ziel-und umgebende Flüssigkeit. </li><li> Halten Sie die Geräte stationär, Fokus der Videokamera auf der Laser-Blatt bis alle Partikel scharf erscheinen und im Fokus. Sobald der Laser Blechebene im Fokus ist, schalten Sie die Kamera auf manuellen Fokus-Modus. Dies wird die Kamera vom Neuausrichtung auf alle Objekte, die im Bereich der anscheinend verhindernBlick während der Messung, was zu unscharfen Partikel in der Laser-Blatt. </li><li> Zur Kalibrierung SCUVA, platzieren Sie ein Objekt mit bekannten Abmessungen in der Laser-Blatt in der Video-Kamera Sichtfeld. Rekord für mehrere Sekunden. Nach dem Tauchgang wird ein Bild aus dieser Videosequenz extrahiert werden, um eine Kalibrierung Konstante, die die Bildfeldgröße Konvertiten aus Einheiten der Pixel cm zu bestimmen. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt den Betreiber stellt die Bildfeldgröße re-positionieren Sie den ausfahrbaren Arm oder das Ändern der Kamera-Zoom während des Tauchgangs werden, wird die Schritte 12 und 13 müssen wiederholt werden. </li><li> Beginnen Sie den Tauchgang mit dem Abstieg der Arbeitstiefe. Auf der Suche nach einem Ziel, müssen die ökologischen bulk Fließeigenschaften bestimmt werden. Falls vorhanden, wird die aktuelle Richtung zu diktieren Apparate und Taucher Positionierung im Verhältnis zu der während der Messungen. Die Richtung der Bulk-flow um das Ziel kann durch die Beobachtung Blasen ausgeatmete aus dem Taucher und betonte deren seitliche Bewegung abgeleitet werden. InZusätzlich zu blasen, kann eine kleine Menge an Fluoreszenzfarbstoff (dh Fluorescein) veröffentlicht, um die aktuelle Richtung zu bestimmen. Da Taucher-generated Flow eine Quelle der DPIV Messfehler werden können, sollte der Taucher nicht vor dem Ziel liegen. Darüber hinaus sollten die Laser-Folie parallel zur Richtung des Stroms positioniert werden, um Partikel Verweilzeit innerhalb des Laser-Blatt zu maximieren und minimiert dadurch DPIV Fehler. Allerdings, wenn kein Strom-oder Bulk-flow vorhanden ist, werden Taucher und SCUVA Positionierung relativ zum Ziel uneingeschränkt. </li><li> Position SCUVA zu beleuchten und notieren Sie die fließenden Bewegung um ein Ziel. Wenn Sie versuchen, den Fluss umgebenden ein bewegliches Ziel Rekordergebnis für das erste Vorhersage der Lage des Ziels, und dann Position SCUVA, um die vorhergesagte Position, während verbleibenden regungslos. Da das Ziel bewegt sich durch die Kamera Sichtfeld, beginnt die Aufnahme. Wenn das Ziel unbeweglich Rahmen der Ziel-und umgebende Flüssigkeit in die Videokamera &amp;# X2019; s Blickfeld und beginnt die Aufnahme, während verbleibenden regungslos. Der Betreiber sollte von Rotations-und out-of-plane Bewegungen während der Videoaufnahme, da diese Bewegungen führen zu fehlerhaften DPIV Ergebnisse zu unterlassen. Daher Messungen während Rotations-und out-of-plane diver Bewegungen werden nicht für die weitere Datenanalyse verwendet werden gesammelt. </li><li> Sobald Video-Sammlung abgeschlossen ist, schalten Sie alle Komponenten des SCUVA und Wiederherstellen der Laserarm seiner zurückgezogenen Position. Entfernen SCUVA aus dem Wasser und lösen Sie die Kamera-und Laser-Gehäusen aus dem Arm. Behandeln Sie den Apparat in frischem Wasser vor dem Trocknen zu verhindern Rostbildung an den Apparat. Sobald das Gehäuse getrocknet sind, entfernen Sie Komponenten aus dem Gehäuse, und laden Sie und ersetzen Sie die Batterien, wenn für einen weiteren Tauchgang nötig. </li><li> Verbinden Sie die Video-Kamera an einen Computer und extrahieren Video von der HD-Band mit einem HD-Video-Software-Paket (dh, Adobe Premiere Pro oder iMovie). Nach dem Video extrahiert wird, bestimmen den Bereich derVideo in einer Reihe von Bildern für DPIV Analyse umgewandelt werden. Stellen Sie sicher, dass die Pixel-Seitenverhältnis und extrahiert Bildgrößen der HD-Video-Einstellungen übereinstimmen. </li><li> Diese Bilder sind eine DPIV Textverarbeitungsprogramm (z. B. Davis oder MatPIV) importiert. Nach Auswahl des richtigen Kalibrierung konstant und Bilderfassung Parameter, die aus der DPIV Software-Paket dazu aufgefordert werden, kann die Geschwindigkeit Felder aus aufeinanderfolgenden Teilchen Bilder erzeugt werden. Zusätzliche Nachbearbeitungsschritte, je nach Qualität und Art der Messungen, kann auch angewendet werden. Werden 3 </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt ausgeführt wird, wird das Teilchen Bilder rund um das Ziel scharf und leicht zu unterscheiden. Mit dem Partikel-Felder in situ durch SCUVA die Videokamera (Abbildung 1A) und einem DPIV-Software-Paket, Geschwindigkeits-feldern der Strömung um das Ziel (Abbildung 1B) erfasst wird enthüllt werden. Vektoren in der Velocity Feld deuten auf Größe und Richtung der lokalen Strömungsgeschwindigkeit. Wenn genügend Video wird gesammelt, um eine Zeitreihe von Bildern bieten, können eine Zeitreihe der Geschwindigkeit Felder bestimmt werden. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 in situ Partikel-Felder (A) um Aurelia labiata gemessen. Entsprechende Geschwindigkeitsfeld (B) mit gelben Vektoren anzeigt, Fließrichtung und Größenordnung. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2 In-situ-Partikel-Felder um Mastigias sp. Und Solmissus sp. (A bzw. B). Roter Pfeil in A zeigt einen Bereich hoher Reflektivität, die in die Sättigung des Bildes Ergebnisse, so dass es schwierig ist, zwischen Partikel und das Ziel zu unterscheiden. Roter Pfeil in B zeigt eine Region von Schlieren, die entsteht, wenn der Durchflussnicht mit einer ausreichend hohen Frequenz abgetastet.

<ol>
	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine mögliche Einschränkung im Bereich ist der Bedarf an Partikeln in der Strömung, die erforderlich sind, um digitale Particle Image Velocimetry (DPIV) umzusetzen sind. In Küstengewässern, zeigt Schwebstaub in der Größenordnung von 10 &amp;mgr; m im Durchmesser und Konzentrationen zwischen 0,002 und 10 pro mm 3. 4 Weitere Studien mit einer Tauchpumpe holocamera für Teilchennachweis bestätigen ausreichende Vorhandensein von Seeding Partikel DPIV in Meerwasser führen. 5 Während offene Meer und Küste Meer tauchen, haben wir festgestellt, dass Partikeldichten und Größen sind nicht eine Einschränkung für die Durchführung von in situ DPIV. Abgesehen von Partikeldichten und Größen, ist ein weiteres Anliegen relevant DPIV Messungen die Homogenität der Partikel-Konzentrationen. Qualitativ, wenn eine Region innerhalb eines Verhörs Fenster hat eine größere Partikel-Konzentrationen als die andere, die Geschwindigkeit Größenordnung von der D erzeugtPIV-Analyse wird für die Region mit höheren Partikelkonzentrationen vorgespannt werden. Daher muss SCUVA Messungen durchgeführt, wo Partikelkonzentration Variabilität ist minimiert werden. Wir fanden thatcle Konzentrationen sind relativ konstant bei Partikelkonzentrationen sind relativ konstant bei Tauchgängen, wo die Taucher in der Mitte der Wassersäule ausgesetzt ist. Allerdings haben Teilchen Felder in benthischen Umgebungen das Potential für Inhomogenität durch Aufwirbelung von Partikeln durch Umwelt-oder Taucher-induzierte Ströme in der Nähe des Meeresbodens. Es ist darauf zu Störungen der Partikel während der Messung in benthischen Umgebungen zu minimieren. Um Wissen der Autoren, hat eine formale Analyse von Fehlern durch inhomogene Partikelkonzentration erzeugten Felder weder in Labor-oder Feldbedingungen durchgeführt worden, und sollte ein Thema für weitere Überlegungen in einer separaten Publikation werden. Mehrere verschiedene Aspekte sollten berücksichtigt werden, wenn die Vorbereitung und werdenDurchführung von in situ Experimente mit dem Protokoll. Während der Aufnahme ist der Betreiber angewiesen, stationär bleiben und alles unterlassen, alle out-of-plane-und Drehbewegung. Diese Anforderung wird in der Theorie einfach, aber in der Praxis schwierig, und diese Messungen erfordern erweiterte Tauchfertigkeiten erfolgreich abgeschlossen werden. Out-of-Ebene und Drehbewegungen des Betreibers führen zu fehlerhaften DPIV Daten. Allerdings können in-plane Bewegungen mit in-house Software korrigiert werden. 6 Es an den Betreiber zu Tarierungskontrolle für mehrere Tauchgänge zu üben, bevor mit SCUVA um die Messung zu maximieren wird empfohlen. Neben Auftrieb Überlegungen sollte sich der Betreiber des Ziels Fließrichtung. Flows, die out-of-Flugzeug reisen bezogen auf die Laser-Folie wird keine zuverlässigen DPIV Ergebnisse, und der Betreiber sollte orientieren SCUVA, diese Ströme am effektivsten zu erfassen. Darüber hinaus muss die Position des Tauchers in Bezug auf das Ziel sein Selected so zu minimieren, Taucher-induzierte Strom in den Messungen. Diver-Induced Flow stellt Fehler zum Ziel fließen, und Messungen, die Taucher Effekte sind nicht für die weitere Analyse verwendet werden. Für den Fall, dass das Ziel eine stark reflektierende Oberfläche hat, wird die Flüssigkeit Region um das Ziel stark beleuchtet werden, wodurch es schwierig wird in der Nähe einzelner Partikel aus der Umgebung Flüssigkeit (Region durch den roten Pfeil, 2A angegeben) zu unterscheiden. Filter oder Polarisatoren können mit dem Laser oder Kamera-Gehäuse hinzugefügt werden, um die Intensität des Laserlichts durch die Video-Kamera-Sensor erfasst zu reduzieren. Wenn dies nicht möglich ist aufgrund logistischer Zwänge und eingeschränkten Zugang zu Ausrüstung, Nachbearbeitung von Bildern mit in-house-Software kann eine ausreichende Korrektur durch Subtraktion von den Bildern der erhöhten Pixelintensitäten in der Nähe des Ziels liefern. Eine weitere Überlegung, dass die Qualität der Daten betrifft DPIV ist, ob Partikel Streifen vorhanden sind. Wenn TeilchenFelder Regionen Schlieren (gekennzeichnet durch den roten Pfeil, Abbildung 2B), ist die Video-Kamera mit einer Bildrate zu niedrig Aufnahme, um diese hohen Geschwindigkeiten zu lösen. Durch die Erhöhung der Bildrate können Partikel Streifen reduziert werden. Dies führt jedoch zu einer Reduktion des Lichts erreicht die Videokamera-Sensor und macht die Partikel Bereich aussehen Dimmer. Wenn die Video-Kamera hat die Fähigkeit, manuell Blende, erhöhen Sie die Blendeneinstellung zu verhindern Dimmen des Teilchens Feld. Die Bestimmung der optimalen Geräteeinstellungen erfordert möglicherweise mehrere Tauchgänge mit SCUVA, bevor erfolgreiche Datenerhebung.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

Die Möglichkeit, direkt zu messen Geschwindigkeit Felder in einer flüssigen Umgebung ist notwendig, um empirische Daten für Studien in so unterschiedlichen Bereichen wie Ozeanographie, Ökologie, Biologie und Strömungsmechanik bieten. Feldmessungen einführen praktische Herausforderungen wie Umwelt-Bedingungen, Tier-Verfügbarkeit und die Notwendigkeit für Feld-kompatiblen Messverfahren. Zur Vermeidung dieser Herausforderungen, Wissenschaftler verwenden in der Regel kontrolliert Laborumgebungen zu Tier-Fluid-Interaktionen zu untersuchen. Allerdings ist es vernünftig zu fragen, ob man das natürliche Verhalten zu extrapolieren (dh, das, was geschieht im Feld) aus Labormessungen. Daher sind in situ quantitative Durchflussmessungen notwendig, um genau zu beschreiben Tier schwimmen in ihrer natürlichen Umgebung. Wir haben eine in sich geschlossene, tragbares Gerät, das unabhängig von einer Anbindung an die Oberfläche arbeitet, und können quantitative Messungen des Strömungsfeldes surrou bietennden ein Tier. Dieses Gerät, ein in sich geschlossenes Unterwasser-Velocimetry Geräten (SCUVA), kann von einem einzigen Taucher in Tiefen betrieben werden bis zu 40 m. Durch die zusätzliche Komplexität innewohnt der Feldbedingungen, weitere Überlegungen und Vorbereitungen sind erforderlich, wenn auf Labormessungen verglichen. Diese Überlegungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Betreiber Motion Limited, Vorhersage Position des Schwimmens Ziele verfügbaren natürlichen Schwebstaub und Ausrichtung von SCUVA in Bezug auf den Fluss von Interesse. Das folgende Protokoll soll diese gemeinsame Feld Herausforderungen zu bewältigen und die Messung Erfolg zu maximieren.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Dieses Protokoll enthält Anweisungen, wie man ein sich geschlossenes Unterwasser-Velocimetry Geräten (SCUVA), die für die Quantifizierung der in situ Tier-generated fließt ausgelegt ist zu verwenden. Darüber hinaus behebt dieses Protokoll Herausforderungen Feldbedingungen gestellt und umfasst Betreiber Bewegung, vorherzusagen Position der Tiere und Ausrichtung der SCUVA.

Quantitativen Messung In situ Flows mit einem Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K Aufrufe.  Woods Hole Oceanographic Institution. Dieses Protokoll enthält Anweisungen, wie man ein sich geschlossenes Unterwasser-Velocimetry Geräten (SCUVA), die für die Quantifizierung der in situ Tier-generated fließt ausgelegt ist zu verwenden. Darüber hinaus behebt dieses Protokoll Herausforderungen Feldbedingungen gestellt und umfasst Betreiber Bewegung, vorherzusagen Position der Tiere und Ausrichtung der SCUVA.

Serie: Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Elektrospinnen Grundlagen: Optimierung Solution und Geräteparameter

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Forschung

Biotechnik

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...