Wir möchten Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi und Kristina Wullimann für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir danken W. Macklin für die Bereitstellung Plp-GFP Mäusen. , Von der Alexander-von-Humboldt-Stiftung und von der nationalen Förderagentur (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot;; TM wird durch das Institut für Höhere Studien (Technische Universität München), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) unterstützt ) im Rahmen des ERA-Net NEURON &quot;iPSoALS&quot; und &quot;2-Photonen-Imaging&quot;. TM und MB werden vom Center for Integrated Protein Science (München) unterstützt. PM wurde von der Graduate School der Technischen Universität München (TUM-GS) unterstützt.

Ein. Triangularis Sterni Explantation (Abbildung 1) Timing: 15 min. <ol><li> Bereiten chirurgische Instrumente: 2 Paar Zangen, 1 Schere, 1 Paar Frühjahr Schere, 1 Gewebekulturschale (10-cm). Pre-Blasen (mindestens 15 min) gekühlt (4 ° C) Ringer-Lösung mit 5% CO 2/95% O 2. Füllen Sie 15-cm Gewebekulturschale mit Eis und bedecken Sie es mit Metallplatte. Planen Dissektionsmikroskop und legen die 15-cm-Schale mit Eis unter der Dissektion Umfang um das Explantat beim Präparieren kühlen. </li><li> Lethally betäuben der Maus durch Isofluran Überdosierung (oder einem anderen anerkannten Methode des Opfers). Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol zu Pelz Kontamination der Explantation zu verhindern. Für SC Bleichen, verwendeten wir Plp-GFP-Mäuse, die Thy1-OFP3 oder Thy1-Membow13 zur gleichzeitigen Visualisierung der Axon überquert werden können. </li><li> Mit dem Paar große Schere, einen Medianschnitt desdie Haut über dem Brustbein und zwei Einschnitte parallel zur unteren Kante des Brustkorbs. </li><li> Mit dem Paar große Schere, die Haut entfernen, öffnen Sie die Bauchdecke, und machen Einschnitte parallel zum Rippenbogen den ganzen Weg zurück auf die Wirbelsäule. Dann sezieren off die Brustmuskeln durch Einschnitte in der Nähe des Muskels Einsetzen an dem Brustbein. </li><li> Schneiden Sie die Blende geöffnet knapp unterhalb der xiphoid Knorpel und sezieren off der Membran entlang ihrer Küsten-Insertionen. </li><li> Halten des Brustkorbs des Xiphoid mit einem Satz von Zangen, startet das Schneiden der Rippen von der Wirbelsäule, so nah wie möglich an ihrer Insertionen. Die linke und rechte Schnitte sollten oberhalb des Herzens in Richtung Man. sterni konvergieren. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden großen Blutgefäße (vor allem die subclavia). Bessere Sichtbarkeit wird durch leichtes Anheben der Vorbereitung, während auf den Xiphoid mit einer Pinzette erreicht. </li><li> Machen Sie einen Schnitt quer unterhalb des Man. sterniund übertragen das Explantat in den 10-cm-Spiegel mit gekühlter 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung. Legen Sie die 10-cm-Spiegel auf der Metallplatte für den 15-cm Gewebekulturschale mit Eis gefüllt. Alle weiteren Schritte sollten unter der Dissektionsmikroskop durchgeführt werden. </li><li> Mit kleinen Feder Schere entfernen Sie die Reste des Thymus, Pleura, Zwerchfell (innen) und Brustmuskeln (außerhalb; 1B-D). </li><li> Um das Explantat in dem 3,5-cm-Schale passen, sezieren off alle Rippen, die nicht mit dem Brustbein haben einzufügen. Dies geschieht am besten mit kleinen Feder Schere und Schneiden des Gewebes in zwischen den Rippen (1E). </li><li> Pin der triangularis sterni Nerv-Muskel-Explantat in die Sylgard beschichtet 3,5-cm Gewebekulturschale mit minutien Stifte (verkürzt auf &lt;4 mm; Figur 1G). Zwei Stifte sollten durch knorpeligen (weiß) Teilen des Brustbeins zu gehen. Legen mindestens zwei Stifte durch die Rippen sowohl auf der linken und rechten Seite des the Explantat Ziel für die weicheren Teile und knorpeligen Vermeidung der Rippen unter oder nahe der triangularis Muskel. Je mehr Nadeln verwendet werden, desto besser (wir verwenden typischerweise 8-10). Wie Sie unten Stift die Vorbereitung, stellen Sie sicher, dass die Rippen etwas verteilt sind, zur Festsetzung der Muskel in einer leicht gestreckten Position. </li><li> Optional: Visualisieren synaptischen Seiten mit Acetylcholin-Rezeptoren, indem Bungarotoxin gekoppelt Alexa-Farbstoffe (Konzentration von 0,8 pg / ml in 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung). Inkubieren merken Explantat in Sylgard beschichtete Schale für 15-20 min bei Raumtemperatur dann waschen mehrmals mit 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung. </li></ol> 2. Bleaching SCs und optionale Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 2) Timing: 30 - 45 min + optional 1 bis 5 Stunden für Zeitraffer. <ol><li> Transfer 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Gericht zu einem konfokalen Mikroskop ausgestattet with ein Argon-Laser (488 nm Wellenlänge) und dem Eintauchen in Wasser Objektive (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 NA und 100x, 1,0 NA oder 60x, 0,9 NA). </li><li> Optional für Zeitraffer-Mikroskopie: Insert 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Schale in Heizring, installieren Superfusionssystem und den Temperaturfühler (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass keiner von ihnen das Explantat, der Rand des Spiegels oder des Sylgard Beschichtung berühren. Erhitzen der Probe auf 33-35 ° C. Für SC Bleichen ohne Zeitraffer, Raumtemperatur ist besser, als Zellen weniger Dynamik zwischen Bleich-Schritte zeigen. </li><li> Mit einem 4x Luftobjektiv beobachten Innervationsmuster triangularis sterni Muskeln und finden triangularis sterni Endplatte Band. Wechseln Sie zu 20x Tauchen-cone Ziel und die Suche nach oberflächlichen Regionen innerhalb der Endplatte Band (Bereiche darüberliegenden Rippen sind gute Kandidaten). Ändern Ziel 100x oder 60x Tauchen-cone Ziel auf einzelne NMJs überprüfen. Ideal ist ein NMJ, die von mehreren SCs abgedeckt und befindet sich in unmittelbarer superficially (2B). Wenn Sie Zeitraffer-Aufnahmen nach dem Bleichen durchzuführen, wählen Sie bis zu 3 NMJs, die relativ nahe beieinander liegen, um die Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Erwerben Sie eine konfokale Abbildung des NMJ vor Fotobleichen einzelne SCs (Abbildung 2B). (Für volle Auflösung Bildgebung auf einem Olympus FV1000 Mikroskop zB, verwenden Sie eine 100x, 1,0 NA objektive und 2,5 Zoom, der in Nyquist-limited Probenahme von ~ 0,1 um pro Pixel führt.) </li><li> &quot;Park&quot; der 488 nm Laserstrahls zentral auf dem Kern einer SC mit voller Leistung für 5 Sekunden (alternativ ein effizientes Abtastmuster in einer kleinen Region von Interesse verwendet werden kann, wie der &quot;Tornado-Scan&quot;-Funktion auf einem Olympus-Mikroskop; da wir ein Konfokalmikroskop zu verwenden, wird der Laser in die Bild-konjugierten Ebenen fokussiert und daher bei 488 nm mit einem Objektiv von 1,0 NA, &lt;0,5 um im Durchmesser). Auf die Zelle und Richter Bleichergebnis neu ausrichten. Wenn nötig wiederholen Bleichschritt erst wieder GFP Ebenen sind zu reduzierend in der Nähe Hintergrund-Ebenen. Erwerben Sie ein Bild nach dem Bleichen (Abbildung 2C). Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die gebleichte Region außerhalb jeder Überlappung zwischen zwei Zellen ist - wenn es eine Überlappung wird Bleichmittel in einer zweiten Zelle offensichtlich sein. </li><li> Wiederholen Sie Schritt vor, bis alle, aber ein SC gebleicht werden (Abbildung 2D-E). Der letzte &quot;rohen&quot; SC eignet sich für die konfokale Zeitraffer-Mikroskopie. Rekonstruieren Einzelzellen durch Subtraktion der Bilder, zB mit Photoshop Software, um einzelne SC Morphologie und Gebiet (2F) abzugrenzen. Seien Sie sich bewusst, dass die Subtraktion zweier Magier fügt Rauschen (zB durch Import in Folge &quot;Schichten&quot; in Photoshop festlegen und dann die obere Kanal auf &quot;Differenz&quot; in der Drop-Down-Menü am oberen Rand der Kanäle tab). Dies kann durch die &quot;Flecken Entfernen&quot;-Funktion auf den Kanälen vor Abzug und Zuschneiden entfernt einen Hintergrund, die offensichtlich nicht von der nicht stammen umgangen werdengebleichten Zelle. Um den Kontrast zu optimieren, kann es erforderlich sein, um die Helligkeit der zwei Kanäle in dem &quot;Ebenen&quot; Fensters zu verändern. Das resultierende Bild des gebleichten Zelle ist die überlagert auf dem Originalbild einer Synapse, pseudo-farbig in einer einzigartigen Farbton und transparent gemacht, das Gebiet des gebleichten Zelle im Originalbild farblich (ab dabei für alle gebleichten und der letzte , ungebleicht Zellen das Bild in Abbildung 2F Ergebnisse gezeigt). </li><li> Optional: Start konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie nach dem Bleichen alle, aber ein SCs. Aufnehmen eines Bildes in festen Abständen (beispielsweise alle 5 bis 10 min). Verwenden Sie so wenig Laserleistung wie möglich. Bis zu 3 NMJs können an der gleichen Sitzung abgebildet werden. </li><li> Machen Sie eine Karte der Zeitraffer NMJs, indem ein Bild mit 100x ohne Zoom, dann Bilder der Region mit 20x und 4x Ziele (Abbildung 2G-I). Diese &quot;Karte&quot; wird benötigt, um NMJs nach Immunhistochemie einer festen Muskeln zu finden. </li><li> Bei Bild-Verarbeitung, Umwandlung einzelner Bilder in maximaler Intensität Projektionen und speichern im TIFF-Format. Kombinieren Sie alle z-projizierte Zeit-Punkte in einem Stapel und richten in xy, zB mit dem &quot;stackreg&quot; plugin 10 in Fidschi (ein Paket auf dem Open-Source-Software ImageJ basiert; National Institutes of Health). </li></ol> 3. Fixierung und Immunhistochemie (Abbildung 3) Timing: Übernachtung. <ol><li> Übertragen des Explantats in einem 50-ml-Reaktionsgefäß mit mindestens 15 ml 4% PFA durch vorsichtiges Entfernen der Stifte. Post-fix die vordere Brustwand mit dem triangularis sterni Muskel für 1 Stunde auf Eis. Spülen fixierten Gewebes mit 0,1 M Glycin in PBS (um restliches Fixiermittelpartikel quenchen und verringern somit Hintergrund) für mindestens 10 min. Proben können an dieser Stelle gespeichert und verarbeitet werden später. </li><li> Übertragen festen Explantat zu einem 10-cm Sylgard Gewebekulturplatte Gericht mit 0,01 M PBS gefüllt. Schneiden Sie eine Trapezform mit einer side parallel zum Brustbein und die andere durch die Knochen-Knorpel-Übergänge - diese enthält die triangularis Muskeln auf seiner Oberfläche. Entfernen Sie den unteren Rippen mit einer horizontalen (dh trans-sternal) geschnitten, so dass das kaudale Ende des triangularis Muskeln frei zugänglich ist (Abbildung 3A-D). </li><li> Einfügen einer Injektionsnadel als Stift in den oberen Teil des Trapezes (3E). Verwenden einer subkutanen Nadel, die an einer 1 ml Spritze und der Pinzette triangularis Muskel auf der Oberfläche zu entfernen durch leichtes Festhalten eines kaudalen Ecke des Muskels und mit der Nadel als Mikro-Skalpell. Sicherstellen, dass Schnitte parallel zu der Ebene der Brustwand hergestellt. Sobald die kaudalen Teil des Muskels wird freigesetzt, legen Sie eine andere Injektionsnadel als Stift unterhalb des Muskels durch die Brustwand - das lähmt die Vorbereitung und ermöglicht Ausüben eines leichten Zug auf den Muskel mit einer Pinzette (3F). Wie Sie schneiden Binde tissue Insertionen, &quot;peel&quot; weg der Muskel aus dem Thorax. Cut letzten caudal Befestigung mit Feder Schere. Entfernen Sie Fett und Blutgefäße Überreste mit einer Pinzette. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zerreißen weg die Nerven. Hinweis: Verwenden Sie getrennte Gruppen von Werkzeugen und Geschirr für die Arbeit mit lebenden und fixierten Gewebe. </li><li> Starten Immunhistochemie (mit einem Standard-Protokoll) durch Übertragen Gewebeproben in Blockierlösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Zimmertemperatur. Kleinstmöglichen Volumen für die Färbung ist 200 ul mit einer 96-Well-Platte. </li><li> Bewerben Primärantikörper in Blocking-Lösung wurden 200 ul pro Well über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler verdünnt. </li><li> Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min. </li><li> Anwenden geeigneter sekundärer Antikörper für 1-2 h bei Raumtemperatur in Blockierungslösung verdünnt. </li><li> Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min. </li><li> Montieren Sie in der Anti-Fading-Medium (zB Vectashield) und Deckglas. </li><li> Objektträger auf magnetischen Metallplatte, Ort Magneten aufder Probe für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 ° C abzuflachen Dichtung mit Nagellack. </li></ol>

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der SC Bleichen hier vorgestellte Methode ist einfach, schnell und vielseitig: (i) Es ermöglicht enthüllt einzigen SC Morphologie und Dynamik durch konfokale Mikroskopie auf einer einzigen Transgen basiert - und das ist ein wesentlicher Vorteil bei der Kombination der Ansatz z. B. mit der Krankheit Modelle, die zusätzliche Allele erfordern . (Ii) Das Verfahren ist schnell, wie aus Dissektion zur Fixation in einem halben Tag durchgeführt werden kann. (Iii) Die Anzahl der Anwendungen ist breit, wie es mit and...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Company (Beispiel) </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 70% (Vol / Vol) Ethanol-Lösung </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> in Sprühflasche </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> jede andere zugelassene Betäubung kann für tödliche Anästhesie verwendet werden </td></tr><tr><td> transgenen Mäusen (Plp-GFP) </td><td></td><td></td><td> von zitierten Quellen gewonnen werden </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop mit Kaltlichtbeleuchtung </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> ausgestattet mit Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> Pinzette #2 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> Schere, große medizinische </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> Schere, kleine abgewinkelte Feder </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> Durchlauferhitzer </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> Heizen Ring für 3,5-cm-Schalen </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Kanal-Temperaturregelung </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Superfusion Pumpsystem </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> gefüllt mit Eis und abgedeckt Metallplatte </td></tr><tr><td> 10-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> mit sauerstoffreichem Ringer-Lösung </td></tr><tr><td> 3,5-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> gefüllt mit Sylgard Polymers </td></tr><tr><td> Sylgard Polymers </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer Kit </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV1000 </td><td> mit Argonlaser </td></tr><tr><td> 50-ml Reaktionsgefäß </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA in PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Kanüle 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> Kaninchen </td></tr><tr><td> Sekundärantikörpers </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-Well-Platte </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M Glycin in PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> Dias </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien Stifte × 10 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-20 </td><td> verkürzt auf &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin Alexa 594 gekoppelt </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Normal Goat Serum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Glöckner sprudelte mit 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Ausrüstungen. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP 1 und Plp-GFP Mäusen 2. Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs - dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran 3 befinden. Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen 3. Multispektrales &quot;Brainbow&quot; Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen 4 erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck &quot;photoschaltbare&quot; Proteine ​​in SCs noch eine andere alternative 5 sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz - aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit - eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten 6. In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat 7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie 9 nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.

Ein Beispiel eines triangularis sterni Explantat bereit zum Abbilden Schale wird in Figur 1G gezeigt. Diese Explantat eignet sich besonders für bildgebende NMJs ex vivo als die triangularis Muskel besteht nur aus wenigen Lagen von Muskelfasern. Dies ermöglicht den Erhalt hochauflösende Bilder von Explantaten aus transgenen Maus Linien abgeleitet werden, dass entweder Highlight SCs (Plp-GFP 2) und / oder Axone (Thy1-XFP 1). Kritische Faktoren für hohe ...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. &quot;Sequential Fotobleichen&quot; ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunfärbungen.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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Research

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Neuroscience

10.5K Aufrufe.  Technische Universität München. Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. "Sequential Fotobleichen" ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und Post-hoc Immunfärbungen.

Serie: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...