Diese Methode ermöglicht es zu untersuchen, wie der mitochondriale Redoxzustand unter pathophysiologischen Bedingungen beeinflusst wird. Es kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu bewerten, die auf den Schutz der Mitochondrien abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Organ und eine spezifische Beurteilung dynamischer und nachverfolgender Veränderungen des Redoxzustands der Mitochondrien in Echtzeit ermöglicht.
Diese Methode kann mit zusätzlichen Indikatoren kombiniert werden, um neben dem Redoxzustand auch mitochondriales Membranpotential oder Calciumkonzentrationen gleichzeitig zu erfassen. Dieses Protokoll kann auf Kulturzellen, Gewebeexplantaten und Schnittkulturen angewendet werden. Beginnen Sie mit der Optimierung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops.
Stellen Sie dazu den Detektor auf 12 Bit oder 16 Bit ein, aktivieren Sie den sequenziellen Scanmodus und fügen Sie eine zweite Sequenz/Spur hinzu. Wählen Sie für beide Kanäle eine Pseudofarb-Nachschlagetabelle aus, die über- und unterbelichtete Pixel anzeigt, und wählen Sie dann ein Objektiv aus, das für das Objekt von Interesse geeignet ist. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer.
Fügen Sie einen Milliliter Bildpuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren. Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Pixelformaten und Lochgrößen auf.
Nehmen Sie dann Bilder mit unterschiedlichen Laserintensitäten auf und passen Sie die Detektorverstärkung und den Schwellenwert entsprechend an. Nehmen Sie schließlich Bilder mit unterschiedlichen Scangeschwindigkeiten und unterschiedlichen Bilddurchschnitten auf. Stellen Sie für die Live-Bildgebung das Zeitrafferintervall auf 30 Sekunden und die Dauer auf 25 Minuten ein.
Montieren Sie dann die Zellen, legen Sie die Kammer auf das Mikroskop und fokussieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal in der Live-Ansicht, um die Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren. Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Durchlauf zu erhöhen, verwenden Sie optional die Multi-Point-Funktion, um zwei bis drei Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.
Starten Sie die Zeitraffererfassung und nehmen Sie fünf Bilder als zweiminütige Baseline-Aufnahme auf. Fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 3X NMDA-Lösung hinzu, um die Endkonzentration von 30 Mikromol zu erreichen, und zeichnen Sie zusätzliche 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Reaktion auf. Als nächstes fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 4X DA-Lösung hinzu und nehmen sechs weitere Bilder auf.
Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer ab und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter DVB-T-Lösung. Nachdem Sie 10 weitere Bilder aufgenommen haben, beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie. Um die Daten in die Bildanalysesoftware zu importieren, klicken Sie auf Plugins, wählen Sie Bio-Formate und dann Bio-Format-Importer.
Wählen Sie im Dialogfeld Hyperstack im Ansichtsstapel mit aus, legen Sie den Farbmodus als Standard fest und wählen Sie automatische Skalierung. Ändern Sie das Bildformat in 32 Bit, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und dann aus den Optionen 32 Bit auswählen. Um die Farbkanäle in separate Fenster aufzuteilen, klicken Sie auf Bild, gehen Sie zu Farbe und wählen Sie geteilte Kanäle.
Passen Sie den Schwellenwert an, um die Mitochondrien für die Analyse auszuwählen, indem Sie auf das Bild klicken und Anpassen und Schwellenwert auswählen. Wählen Sie im Dialogfeld den standardmäßigen roten dunklen Hintergrund und das Stapelhistogramm aus. Wenn die ausgewählten Pixel rot erscheinen, klicken Sie auf Übernehmen.
Wählen Sie dann Set background pixels to NAN verarbeiten alle Bilder und führen Sie den gleichen Vorgang für Kanal zwei aus. Um das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern zu visualisieren, erstellen Sie ein Verhältnisbild, indem Sie auf Prozess und Bildrechner klicken. Wählen Sie im Dialogfeld Kanal eins in Bild eins teilen in Vorgang Kanal zwei in Bild zwei.
Wählen Sie dann Neues Fenster erstellen und alle Bilder verarbeiten. Ändern Sie die Nachschlagetabelle des Verhältnisbilds in Pseudofarbe, indem Sie auf Bild klicken, Nachschlagetabellen auswählen und dann auslösen. Um das Bild zu analysieren, zeichnen Sie ROIs um einzelne Zellen oder Mitochondrien auf dem Verhältnisbild.
Um die ROIs zum ROI-Manager hinzuzufügen, gehen Sie zu Analysieren, klicken Sie auf die Tools, wählen Sie ROI-Manager, klicken Sie auf Hinzufügen und wählen Sie Alle anzeigen. Um die 405- bis 488-Nanometer-Verhältnisse einzelner Zellen zu messen, klicken Sie auf ROI-Manager, wählen Sie alle ROIs durch Drücken von Control A aus, gehen Sie zu more und wählen Sie multi-measure. Wählen Sie im Dialogfeld Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen aus.
Nachdem Sie die Messungen in die Tabellenkalkulationssoftware exportiert haben, wählen Sie das 405-Nanometer-Bild aus, messen Sie die Intensität aller ROIs und exportieren Sie die Messungen erneut in die Tabellenkalkulationssoftware. Messen Sie in ähnlicher Weise die ROI-Intensitäten des 488-Nanometer-Bildes. Um die ROIs für zukünftige Referenzzwecke zu speichern, wählen Sie alle ROIs aus, indem Sie Steuerung A drücken, gehen Sie zu mehr und wählen Sie Speichern.
Diese repräsentativen Schnappschüsse aus einer Zeitrafferaufzeichnung zeigen Verhältnisbilder von Neuronen vor und nach der NMDA-Behandlung und nach der Max/Min-Kalibrierung mit DA und DTT. Die Behandlung der Neuronen mit 30 mikromolarer NMDA induzierte die Mitochondria-Oxidation innerhalb weniger Minuten. Die Analyse einzelner Fluoreszenzkanäle ergab, dass die NMDA-induzierte mitochondriale Azidose einen Abfall der GFP-Fluoreszenz bei einer Anregung von 405 und 488 Nanometern verursachte.
In einem Kontrollexperiment schloss die Vorbehandlung mit DA eine weitere Mitochondria-Oxidation durch NMDA aus. Und dementsprechend änderte sich das Verhältnis 405 zu 488 trotz einer erheblichen Abschreckung der redoxsensitiven GFP2-Fluoreszenzintensität nicht. Dieses Experiment bestätigte, dass das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern nicht durch pH-Änderungen beeinflusst wird.
In einem separaten Experiment wurden das mitochondriale Membranpotential, der Redoxzustand und die Morphologie parallel bewertet. Die Behandlung der Neuronen mit 60 mikromolarer NMDA führte zum Verlust des Tetramethylrhodamin- oder TMRE-Signals und zu einer Erhöhung des Rho-GFP-Verhältnisses von 405 bis 488 Nanometern, gefolgt von einer verzögerten Auffrischung der Mitochondrien. Wenn Sie mit der Anwendung dieser Methode beginnen, ist es sehr wichtig, sich Zeit zu nehmen, um die mikroskopischen Einstellungen sorgfältig zu optimieren.
Dies wird dazu beitragen, die Neuronen während Ihrer Experimente gesund zu halten. Es ist auch sehr wichtig, die Lasersicherheitsregeln immer zu beachten. Stellen Sie sicher, dass Sie keiner Laserstrahlung ausgesetzt sind, wenn Sie während Live-Aufnahmen Medikamente zur Manipulation hinzufügen.
