Alberto Guiggiani für die Entwicklung des Echtzeit-Steuersystem, Evelina Chieregatti und Hanako Tsushima für aufschlussreiche Diskussionen, Giacomo Pruzzo und Alessandro Parodi für die Entwicklung von kundenspezifischen Elektronik und Software, und Claudia Chiabrera und Marina Nanni für ihre kompetente Beratung und Unterstützung in der Zellkultur Vorbereitung.

1. Optischer Aufbau Das gesamte optische System wurde zuvor 15 beschrieben. Kurz gesagt, wird die optische Pinzette-System auf einer Ytterbium Dauerstrich (CW)-Faser-Laser, der bei 1064 nm (IPG Laser GmbH) basiert. Räumlicher Lichtmodulator (SLM) (LCOS SLM, Modell X10468-07 - Hamamatsu) variiert die Phase des ankommenden IR Laserstrahl, um die Position der Trapping Brennfleck auf der Kulturschale von computergenerierten Hologrammen steuern. Die frei verfügbaren Blue-Pinzette-Software (Web-Link auf Geräte-Tisch) Hologramme auf der Licht-Raum-Modulator projiziert. Und einer Photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs) - Das Interferometer für Kraft-Spektroskopie-Messungen wurde auf einem Vier-Quadranten-Photodiode (Hamamatsu QPD, S5980 mit C5460SPL 6041 board) basiert. Der Laser Dissektion Quelle war eine gepulste Subnanosekundenbereich UV Nd: YAG-Laser bei 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV-Laser - Teem Photonics). Ein akusto-Modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm Quarzglas-AA-Optoelektronische) gesteuert die Leistung des UV-Lasers in die Probe ein. Mit einem 60X, 0,9 NA Eintauchen in Wasser objective.The des Mikroskops von einem 3-Achsen linear Gleichstrommotor Feineinstellplatten besteht ausgestattet - das holographische optische Pinzette und Laser-Mikro-Dissektor wurden auf einer modifizierten aufrechtes Mikroskop (Olympus BX51) integriert System (M-126.CG1, Physik-Instrumente), die eine separate 3-Achsen piezoelektrischen Nano-Positionierung der Bühne (P-733.3DD, Physik-Instrumente), um grobe Bewegung der Probe mit dem Sub-Nanometer-Auflösung des Mähdreschers piezo- Stufe. Das Mikroskop Stufen-System mit zwei Schlaufen ausgestattet synergistisch wirkt, um das Einfangen Brennfleck an der richtigen Stelle zu halten, je nach der gewählten Arbeitsmodus (Position oder Kraftklemme, statisch oder dynamisch) 16. Insbesondere wirkt eine interne Rückkopplungsschleife auf einem piezoelektrischen Bühne, um den Wulst an einer select haltened Abstand aus der Falle entfernt. Die anderen externen Schleife steuert die Position des motorisierten Bühne, um die Region mit den Piezo-Aktor auf eine größere Fläche als die zur Verfügung stehende Hub 17 überspannt auszunutzen. Wenn das Piezo-Stufe die Grenze der zur Verfügung stehenden Hub in einer Richtung erreicht, die äußere Schleife die Mikro Stufe in entgegengesetzter Richtung, wodurch der piezoelektrische wieder in seine zentrale Position, weil es Tracking wird die eingeschlossene Wulst geklebt auf die Probe. Wenn der Piezo-Bühne die zentrale Position seines Kurses Bereich erreicht, stoppte der Mikro Bühne. Weitere Einzelheiten der Anlage sind in Guiggiani et al 16,17 gemeldet. Ein Peltier-Vorrichtung (QE1 Widerstandsheizelement mit TC-344B Zweikanal Heizungssteuerung - Warner Instruments) regelt die Temperatur der Zellkultur unter dem Mikroskop (37 ° C). In der Kultur, pH und Feuchte unter physiologischen Bedingungen durch Belüften eine speziell angefertigte Polydimethyl beibehaltenSiloxan (PDMS) Hülse (Integration des Mikroskop-Objektivs) mit angefeuchteten Carbogen (95% O 2, 5% CO 2). 2. Cell Culture Vorbereitung Alle experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt. Primäre Kulturen wurden aus hippocampi von Mäusen (C57BL6J, Charles River) an embryonalen Tag 18 (E18) erhalten. <ol><li> Neuronen wurden bei einer Konzentration von 25.000 Zellen / ml auf Glasboden-Petrischalen (- MATEK Gesellschaft P35G-0-14-C) beschichtet. Die niedrige Konzentration der kultivierten Zellen benötigt wird, um die Bildung eines dichten Netzes schon in den ersten Tagen in vitro zu vermeiden. Bei der erwähnten Zellkonzentration, ist die Wahrscheinlichkeit des Findens isolierten Zellen mit einer längeren Neuriten nicht an andere Zellen verbunden viel höher. </li></ol> 3. Wulstbeschichtung <ol><li> Polymer-Mikrokugeln (Ø 4 um, COOH-terminierten-Bangs Laboratories, Produkt-Code PC05N/6700) wurden mit Poly-D-Lysin nach dem Verfahren in der Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, Produkt-Code 19539) beschrieben. Die Perlen werden mit dem gleichen Molekül verwendet werden, um die Kultur Unterstützung und für Zellen Haftung Abdeckung beschichtet. </li></ol> 4. Wählen Isolated Neuron. Trennen einer Perle aus der Kultur Substrat, Trap and Move it Neben dem Neuron <ol><li> Legen Sie die Kultur Petrischale am Mikroskop Bühne. Nach dem Setzen des Fokus auf der Probe durch Bewegung Bühne, korrigieren Sie die Position der leuchtenden Ziel Kondensator Kohler-Beleuchtung gesetzt. Ausrichten der Beleuchtung, um die Optik Kolher-Beleuchtung Bedingung ist nötig, damit die Hellfeldabbildung Qualität zu verbessern. Mit einer solchen Ausrichtung Bedingungen ist es auch notwendig, den IR-Laser Abscheidegrad (über Ziel Kondensator) zu maximieren, von der Streuung gefangen Sonde seiner interferometrischen Tracking der QPD und PD durchzuführen. </li><li> Pipette ein paar ul des beschichteten Mikrokügelchen Stammlösung inder Kulturschale. Mikrosphären werden hinterlegen und sich an die Kultur Substrat. Die Zahl der ul in der Kulturschale injiziert hängt von der Konzentration der Mikrokügelchen Stammlösung. Der Idealzustand ist, zwischen einem und zwei Mikrosphären pro Bildgebung Sichtfeld haben. Wenn zu viele Mikrokugeln in die Kulturschale gegeben werden, können sie bereits zufällig Befestigung zu den kultivierten Neuronen. </li><li> Bewegen Sie sich in der Kulturschale, die Suche nach einem isolierten Neuron mit einer längeren Neuriten (das Axon), und speichern Sie die Position des Mikroskops. </li><li> Bewegen Sie sich und suchen Sie nach einem Wulst verklebt auf der Kultur-Unterstützung. </li><li> Schalten Sie den IR Fanglaser. In diesem Stadium werden keine Hologramme auf SLM projiziert wird, und die Position des IR Laserpunkt fällt mit der UV Laserfleckposition. Stellen Sie die axiale Position der Stelle IR 2-3 um über der Kultur Auflagefläche durch Mikroskoptisch Bewegung. </li><li> Stellen Sie den UV-Laser zugeführte Energie der Probe auf weniger als 1 uW. DieUV-Laser dissector wurde bisher 14 kalibriert: 5-6 uW der Glasträger abgetragen 4 uW eine neuronale Verbindung wird vollständig zerlegt 2,5 uW ein Neuriten teilweise lädierten wird &lt;1 uW eine Schockwelle in der Kulturschale hergestellt. Die optische Stoßwelle ist stark genug, um den Wulst von dem Glasträger zu lösen. </li><li> Schalten Sie die UV-Laser, während die IR-Laser auf, und verschieben Sie die UV-Stelle über dem eingehalten Wulst durch Mikroskoptisches Bewegung. Die Kügelchen löst sich von der Oberfläche, und es wird von dem IR-Laser gefangen. Dann schalten Sie den UV-Laser. </li><li> Bewegen Sie die eingeschlossene Wulst mehrere Mikrometer über dem Glasträger (20-30 um). Anheben der Wulst zu dieser Position wird es von Kontakt mit anderen Zellen, während sie in Richtung des zuvor gewählten Neuron bewegt wird verhindern. Bringen Sie die Perle der zuvor gespeicherte Position der Bühne. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Bühne auf einen niedrigen Wert (10 um / sec), so dass die Drag Fluidkraft nicht übersteigt optischen Falleping Kraft. </li></ol> 5. Bewegen Sie den Trap-Position in Bezug auf den Spot-und Laser Dissector Axon Position von Computer Generated Hologram und Kalibrieren der optischen Pinzette Steifigkeit <ol><li> Bewegen Sie den Wulst auf dem Glasträger auf das Axon zu visualisieren. Der Wulst über der Zelle gehalten kontaktiert zu (etwa 5 um über dem Glasträger) zu vermeiden. </li><li> Bewegen des Mikroskops, um die UV-Fokuspunkt auf der Mitte der Breite des Axons zu bewegen. Speichern Sie die aktuelle Position der Bühne. </li><li> Bewegen Sie den IR Fokusfleck Position computergenerierten Hologramms. In diesem Schritt wird die Phase, in der in dem vorhergehenden Schritt gewählt gestoppt. Wenn der Computer erzeugten Hologramm auf dem SLM projiziert wird, wird das eingeschlossene Wulst bezüglich der Axon bewegt. Wir ziehen die IR Laserpunkt haben die eingefangenen Wulst an der Mitte des Neuriten ausgerichtet ist, mit dem UV-Laser auf dem gleichen Fleck Neuriten zentriert zu. Die IR-Spot und damit die eingeschlossenen Wulst entlang der Neuriten positioniert5-10 um weg von der UV-Spot. Wir ziehen die Position des IR bezüglich der UV Ort in Abhängigkeit von der Geometrie Neuriten. Falls die optische Pinzette nicht mit einem SLM-System ausgestattet sind, kann die Position durch Kippen Spiegel, optische oder akustische Umlenkungen, auf der IR-Strahlengang variiert werden. Der IR-Laser Spot ist vielleicht 5-10 um positioniert weg von der UV-Punktstrahler, optische Wechselwirkung des Strahls mit dem Sezieren gefangen Sonde, die deren Brownsche Bewegung beeinflussen könnten und verändern die Kraftspektroskopie Spuren zu vermeiden. </li><li> Nach der Definition des neuen IR Spot Position in Bezug auf UV-Spot-und Axon Position, bewegen die Bühne, um die eingeschlossene Wulst vom Axon positionieren und zu vermeiden Kollision mit ihm. Bewegen der axialen Position des eingefangenen Wulst zu etwa 2 um oberhalb des Deckglases. </li><li> Richten Sie die QPD zum Zentrum die Interferenzstreifen darauf: x und y QPD differentielle Signale sind Nullen, wenn die QPD zentriert ist. Erwerben Sie 5 Sekunden von der Brownschen Bewegung der eingefangenen Wulst von der InterferometrieMeter, bei 50 KHz Abtastrate. Besorgen Sie sich die Steifigkeit (PN / nm) und Empfindlichkeit (V / nm) von der optischen Falle von dem Leistungsspektrum 18 Verfahren. </li></ol> 6. Befestigen Sie die Perle der Axon. Führen Axotomie und Simultaneous Kraftmessung <ol><li> Heben Sie den eingefangenen Wulstposition etwa 4 um über dem Deckglas und verschieben Sie sie in die zuvor gespeicherte Position der Bühne (siehe Schritt 3.2). </li><li> Bewegen Sie den gefangen Wulst unten in Richtung der Axon bis sie die Neuriten. Die Kollision zwischen dem eingeschlossenen Wulst und dem Axon durch die z QPD Signal Erfassen einer Verschiebung des eingefangenen Wulst in axialer Richtung überwacht. </li><li> Warten Sie 10 Sekunden mit dem eingefangenen Wulst geschoben gegen das Axon seine Haftung auf dem neurite Membran begünstigen. </li><li> Bewegen der Mikrotisch um die gefangenen Wulst aus dem Axon verdrängen und damit die Prüfung seiner Haftung an der Zellmembran. Wenn der Wulst verklebt, entweicht es aus dem optischen Falle. </li><li> Bringen Sie den Laserfalle am eingehalten Wulstund auf die Kraft-Clamp-Schleife mit Kraft Zustand gleich Null schalten. Auf diese Weise sind die Piezo-Stufe positioniert den Wulst, der an der Zelle auf der optischen Falle entfernt. Wenn das System nicht über eine Rückkopplungsschleife Steuerung kann die Laserfalle Position durch das Mikroskop Bühne zu zentrieren es auf der eingehalten Sonde bewegt. Das Zentrum des Abscheiders erreicht wird, wenn die QPD Signale die gleichen wie bei der Wulst eingeschlossen ist und nicht in die Zelle (x und y QPD Signale gleich Null ist, und die z QPD Signal gibt die gleiche Spannung Summe der vier Quadranten verklebt sind als wenn der Wulst weit von jeder Oberfläche eingeschlossen). </li><li> Festlegen eines Kraft-Clamp Zustand auf der z-Achse, die Positionierung der Fanglaser etwas über der Mitte der Wulst (etwa 100 nm), um eine Vorspannung auf der haftenden gefangen Sonde zu erzeugen. Falls das System nicht mit einer Kraft-Klemme ausgestattet, kann die optische Falle Position nach oben in Schritten von 25 nm erhöht werden, indem dem Mikroskoptisch. Die z QPD Signal ermöglicht die Überwachung. Daher verwenden this Signal, um die Position des Laser-Falle in Bezug auf die Einhaltung Sonde einzustellen. Eine solche Vorspannung ist erforderlich, um die Belastung der Membran nach der axonalen Läsion, und die sich daraus ergebende Abnahme der Brownschen Bewegung des anhaftenden Sonde abzutasten. Ein ähnlicher Ansatz wurde auf die Messung der Freisetzung von Spannungen in einer Membran Halteseil von Video-Imaging 19 vorgeschlagen worden. </li><li> Abschaltung der Kraft-Clamp-Feedback, um die Kraft auf die eingehalten Sonde in der Lage-Clamp-Zustand (der Piezo-Bühne wird blockiert) messen. </li><li> Starten gleichzeitige Aufnahme der Sonde eingefangen Positionen durch das Interferometer (20 KHz Sampling-Frequenz) und der Zelle während der Laser Axotomie Zeitraffer Hellfeldaufnahme (20 Hz Bildrate). </li><li> Schalten Sie die UV-Laser, Laser-Impulse liefern, bis eine Läsion sichtbar auf das Bild des Axons (in der Regel 200-400 optischen Impulse benötigt Energie pro Puls:. NJ 25), und schalten Sie dann die UV-Laser. </li><li> Aufnahme fortsetzen durch das Interferometer für ca. 3 kmn, bis die x-, y-und z QPD Spuren ein Plateau erreicht. </li></ol> 7. Quantifizierung der insgesamt Spannungsstifte <ol><li> Konvertieren Sie die aufgezeichneten Spuren QPD (in Volt) durch die kalibrierte Empfindlichkeit der optischen Falle, um die jeweiligen Spuren in Nanometern zu erhalten. </li><li> Filtern der x-, y-und z-Verschiebung Spuren durch ein Hochpassfilter mit bei 10 Hz geschnitten. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Varianz der gefilterten Spuren, die die Brownsche Bewegung der eingefangenen Perle. Berechnen Sie die Varianz bei 25 ms Schritten für überlappende Zeitfenster von 500 ms (10.000 Datenpunkte) 20. Die Hochpassfilterung Spuren schließt die Änderungen der Brownschen Bewegung durch die Membran Fluktuation oder kortikalen Aktin Bewegung. Die Brownsche Bewegung der Kugel durch die optischen Kräfte und die Adhäsionskräfte an der Zellmembran reduziert. Wenn die Membran aufgrund der Freisetzung von Spannungen seine Viskosität erhöht und damit die Brownsche Bewegung der Raupe wird gespannt, sofort erkanntbar nach Axotomie, zu sinken beginnt. </li><li> Definieren t0: den Beginn der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz, nach der Lieferung von UV Laserenergie. Der Zeitpunkt t0 gibt den Beginn der Membran Stamm. </li><li> Definieren t1: das Ende der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz (wenn es ein Plateau erreicht). Der Zeitpunkt t1 gibt das Ende der Membran Stamm. </li><li> Führen Videotracking von Schmutz oder Kratzer auf der Abdeckung Glasträger, um jede Abweichung von der Probe während der Kraftmessung gemessen. Um die Teilchen auf dem Glasträger verfolgen wir zunächst gelten Schwellenwerte zu den Hellfeld-Bildern, um einen Stapel von binären Bildern mit dem Partikel in weiß auf schwarzem Hintergrund zu erhalten. Dann verfolgen wir das Teilchen Schwerpunkt mit Subpixel-Genauigkeit (unter Verwendung der Freeware ImageJ Software). </li><li> Subtrahieren Sie die gemessene Drift aus den Hubraum QPD Spuren. Multiplizieren Sie die driftkorrigierten QPD Spuren durch den jeweiligen kalibrierten optischen Steifigkeit (k x, k <sub&gt; y, z k), um die Fx, Fy, Fz Spuren in Pikonewton erhalten. </li><li> Berechnen Sie die gesamte Kraft Spur als F ges = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2). </li><li> Berechnen Sie die gesamte Freisetzung von Kraft zwischen t0 und t1 als F = F freigegeben tot (t1) - F tot (t0). Die Kraft, bei t0 gemessen wird, subtrahiert werden, da es aufgrund der Verschiebung der Sonde aus der Falle entfernt ist, wenn die Wulst haftet an der Neuriten. </li><li> Berechnen Sie die Neuriten Kontaktfläche zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition: auf der Hellfeld Maßnahme die lange (L) und kurzen (D) Achsen des Neuriten zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition. Das Axon Kontaktfläche A Axon = L x D. </li><li> Normalisieren der gesamt freigelassene Kraft F Freigabe durch das Axon Kontaktfläche A Axon. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir berichten in dieser Arbeit eine quantitative Methode, um die Neuriten Haftung auf dem Substrat Kultur vergleichen, indem Sie gleichzeitig Kraft-Spektroskopie Messung während laserinduzierten Zelle Läsion. Die gemessene Freisetzung von Spannung auf den Grad der Haftung der Zellen an das Substrat bezogen werden: Zellen mit einer höheren Anzahl von fokalen Adhäsionen zu weniger Verspannungen. Die Messung der Freisetzung von Spannungen in Bezug auf Pikonewton bietet eine physikalische Größe, durch die die axonale ...

Optische Mikroskopie ist eine der weniger invasiven bildgebenden System zur Verfügung zu lebenden Zellen zu beobachten. Mit der Nutzung von Effekten wie Strahlungsdruck (wie in einer optischen Pinzette 1) oder hochenergetischen Photonen-Flux (wie im Laser dissector 2) wurde diese Technologie, um Nano-Manipulation erweitert. Die optische Imaging-System liefert eine präzise Steuerung zu visualisieren und zu manipulieren sub zellulären Targets 3. Zur gleichen Zeit, dank der präzisen Kalibrierung des gelieferten Laserleistung, erreichen optischen Werkzeuge entweder weich oder invasive Probenmanipulation mit beispielloser Reproduzierbarkeit. Mehrere Labors integriert, in derselben Versuchsanordnung, optische Pinzetten und Laser Dissektor um Organellen 4, miteinander zu verschmelzen verschiedenen Zellen 5 oder Zellen durch optisch angetrieben Ladungen 6,7 stimulieren abzutragen. Während optische Pinzette, nach der Kalibrierung des optischen Steifigkeit, für erlaubendie Kontrolle der aufgebrachten Kraft auf die Zelle auf einer Skala Pikonewton können Laser Dissektion Systeme modulieren optische Manipulation, die von Membran Foto-ration der Ablation einzelner Organellen oder Dissektion der sub-zellulären Strukturen reicht. Jedoch beruht Laser Dissektion Kalibrierung auf qualitative Beurteilung der Einheit von optischen Manipulation in Bezug auf die Energie, die an die Probe, vor allem auf Bildanalyse veranschaulicht morphologischen Veränderungen verursacht, die dem Muster 8 basiert. In dem vorgestellten Verfahren zeigen wir, wie man Kraft-Spektroskopie Messung während des Laser axonal Dissektion einer sich entwickelnden Neuronen führen, zu quantifizieren, auf Pikonewton Skala, die Kraft durch eine veränderte Gleichgewicht im Zytoskelett-Struktur eines sub-zellulären Fach 9 produziert. Kultivierten Neuronen an dem Substrat haften, und während der Entwicklung zu polarisieren. Die Polarisation Phase tritt während der ersten fünf Tage in vitro. In Stufe zwei der Polarisierung, einer der Extrudering Neuriten länger wird, und es wird zu differenzieren, um das Axon 10 geworden. Axonal Dehnung in Reaktion auf Zugkraft am Wachstum Kegel wurde zuvor von Dennerl-Modell 11 modelliert. Vor kurzem ist dieses Modell 12 verlängert, um die Rolle von Neuriten Adhäsion an die extrazelluläre Matrix Substrate umfassen. Diese biophysikalische Modell nach experimentellen Beobachtungen 13 vorgeschlagen, zeigten, dass Zugkräfte auf das Wachstum Kegel, der sich entlang der Neuriten, moduliert von fokalen Adhäsionen zu dem Substrat. Ebenso produziert axonale Läsion eine lokale Freisetzung von Spannungen hin ausbreiten Zellkörper. So haben wir vorgeschlagen, dass die Messung solcher freigegeben Spannung an einem Ort entlang des Axons zwischen der Verletzung und der Zelle soma bietet die Möglichkeit, die dämpfende Ergebnis unberührt fokalen Adhäsionen zu bewerten. Wir kalibrieren die notwendige Energie Photon-Fluss des Lasers Dissektor, um das Ausmaß des zugefügten axonalen damag steuerne, von der kompletten Durchtrennung einer partiellen Läsion. Nach der Kalibrierung, wiederholten wir partielle Läsion der Axone von mehreren differenzierenden Neuronen und entwickelte das Protokoll, um die Spannung zu lösen quantifizieren und somit erhalten eine quantitative Parameter, um die Haftung der Axon auf das Substrat 14 zu schätzen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail die entwickelte Protokoll, das eine genaue experimentelle Verfahren zu ermitteln und zu vergleichen mit Pikonewton Empfindlichkeit des axonalen Haftung auf dem Substrat in verschiedenen experimentellen Bedingungen wie chemische Behandlung 14, oder verschiedene Arten von Zellkultur Unterstützung darstellt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

Die Bildung von funktionalen Zusammenhänge in einem Entwicklungsland neuronale Netzwerk wird durch extrinsische Cues beeinflusst. Das Neuritenwachstum von sich entwickelnden Neuronen unterliegt chemische und mechanische Signale, und die Mechanismen, durch die er spürt und reagiert auf mechanische Signale werden kaum verstanden. Die Aufklärung der Rolle der Streitkräfte in Zell-Reifung wird das Design von Gerüsten, die Zelladhäsion und Zytoskelett-Kopplung mit dem Substrat zu fördern und damit die Verbesserung der Fähigkeit der verschiedenen neuronalen Typen nach einer Verletzung regenerieren. Hier beschreiben wir eine Methode, um die gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messungen während der Laser-induzierten Zell-Läsion gelten. Wir messen Spannung Release in der teilweise lädierten Axon durch gleichzeitige interferometrischen Tracking eines optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons. Unsere experimentellen Protokoll erkennt die Spannung Release mit Pikonewton Empfindlichkeit und die Dynamik der Spannung Freisetzung beiMillisekunden-Auflösung. Somit ist es ein hochauflösendes Verfahren zu untersuchen, wie die mechanischen Verbindungen zwischen den Zellen und Substrate moduliert werden kann durch medikamentöse Behandlung und / oder durch unterschiedliche mechanische Eigenschaften des Substrats.

Die Zelle erzeugt Zugkräfte auf dem Substrat durch die fokalen Adhäsionen. Kraft durch Zytoskelett Elemente erzeugt werden, sind im Gleichgewicht mit der Gegenkraft der Kultur Substrat. Nach laserinduzierten Läsion des Neuriten, sind einige der gespannten Zytoskelett Kabel gestört und ihre äquilibriert Spannung befreit wird, da die Gegenkraft der Haftung auf dem Substrat eliminiert wird. Das freigesetzte Spannung teilweise auf die nicht betroffenen fokalen Adhäsionen verteilt und die Wulst an der Zellmembran in ei...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  National Research Council of Italy. Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Serie: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Intraduktale Lieferung an die Kaninchen Brustdrüse

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...