Diese Arbeit wurde teilweise von der spanischen Regierung &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (Projekt AGL2008-05275-C01/ALI) unterstützt, die von der Europäischen Union im 7. Rahmenprogramm Forschung geförderten Projekten VIROBATHE (Contract No 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) und durch die Katalanische Agentur für Wasserwirtschaft, Agència Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Wassersport. Während die entwickelten Studie Marta Rusiñol war Stipendiat der katalanischen Regierung &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. Die Konzentration der viralen Partikel in Wasserproben <ol><li> Sammlung und Aufbereitung von Wässern <ol><li> Sammeln Sie mindestens 2 Wiederholungen von 10 L pro Probe in Kunststoff-Behälter mit flachem Boden und einer zusätzlichen Probe als einen Prozess zu steuern. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge von Viruspartikeln versetzt werden und als eine Kontrolle. Hinweis: Es wird empfohlen, spezielle getrennte Material (Flaschen, Rohre, etc.) für die aufgestockten Proben haben. </li><li> Überprüfen Sie die Kalibrierung des Leitfähigkeitsmesser und neu kalibrieren, wenn nötig. Bereiten Sie eine negative Kontrolle mit Leitungswasser vorher auf die ausreichende Leitfähigkeit eingestellt (siehe unten 1.6) in einem extra Kunststoff 10 l-Behälter. </li><li> Für dotierten Proben: Fügen Sie die Standard-Lautstärke der Kontrolle Virus (ca. 10 5 Genomkopien pro 10 l Wasser) auf die Probe. Mix durch Rühren vermeiden Spritzer und Aerosole. Positive Kontrollen könnten in einer ungewöhnlichen Belastung von Adenovirus s bestehenuch als HAdV-35 oder einem Bakteriophagen wie MS2. </li><li> Wenn die Probe stellt hohe Menge an suspendiertem Material (Sand oder anderen Materialien), lassen Sie es Sediment für 15 Minuten. Übertragen Sie die Wasser in einen neuen Container. </li><li> Den pH-Wert der Wasserprobe auf 3,5 (± 0,1) durch die Zugabe von 1 N HCl. Dieser Schritt ist für die Konzentration der Viren wichtig, so stellen Sie sicher, dass der pH-Wert wurde richtig eingestellt. Mix das Wasser gründlich durch kräftiges Rühren unter Zugabe der HCl. (Hinweis: Wenn der pH-Wert niedriger als 3,5 add 1 M NaOH). </li><li> Passen Sie die Leitfähigkeit. Wenn die Probe hat eine Leitfähigkeit von 1500 S / cm oder höher, ist dieser Schritt nicht erforderlich. Ist die Leitfähigkeit niedriger als 1500 S / cm die Bildung von ausgeflockte Material (Flocken) ist nicht garantiert, so stellen Sie die Leitfähigkeit bis 1500 S / cm durch den Zusatz von künstlichen See Salze (Sigma). Kräftig mischen, unter Rühren unter Zugabe von Meer-Salze. </li><li> Notieren Sie den pH-Wert der Proben vor und nach der Konditionierung als gut eins das Volumen der HCl verwendet. Die Leitfähigkeit sollte auch nach Einstellung des pH aufgezeichnet werden. Immer desinfizieren das pH-Meter und Konduktometer Elektroden mit einem frischen HCl-Lösung, mit 10% iger Lösung tiosulphate entchloren und schließlich mit destilliertem Wasser spülen. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Vor-geflockt 1% Magermilch (PSM) <ol><li> Überprüfen Sie die Kalibrierung des pH-Meter und die Konduktometer und neu kalibrieren, wenn nötig. </li><li> Bereiten Sie vor ausgeflockt Magermilch-Lösung (1% PSM, w / v) durch Auflösen von 10 g Magermilchpulver (Difco) in 1 L künstlichem Meerwasser (Auflösung 33,3 g künstliche Meersalz in 1 l entchlortem Leitungswasser und Autoklaven) und sorgfältig der pH-Wert auf 3,5 mit 1N HCl. Die Flocken sichtbar sein soll. Bereiten Sie die Lösung kurz vor verwendet werden soll oder lagern bei 4 ° C für 24 h Für Dechlorierung Verwendung von 1 ml 10% tiosulphate Lösung pro 100 ml Wasser. </li></ol></li><li> Flockung von Viruspartikeln in Wasserproben<ol><li> Add 100 ml von 1% PSM auf die 10-L Wasserprobe. </li><li> Rühren Sie die Proben für 8-10 h, damit die Viren an die Flocken zu adsorbieren. Verwenden Sie einen Timer zum Abschalten des Rührens nach 8-10 h. </li><li> Stoppen Sie das Rühren und lassen Sie die Flocken Sediment durch die Schwerkraft für 8-10 h. </li></ol></li><li> Das Sammeln und wieder Lösen der Flocken. Zentrifugation <ol><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Schlauchpumpe und einer Kunststoff-Pipette verbunden mit einem Kunststoffrohr. Für dotierten Proben der Überstand sollte in eine Flasche gesammelt und desinfiziert werden nach internen Verfahren. In allen Fällen darauf achten, nicht auf das Pellet zu sammeln. </li><li> Sammeln Sie die Sedimente mit den Flocken (ca. 500 ml) in einer Zentrifuge Flasche. </li><li> Gleichen Sie die Töpfe durch die Zugabe von PSM pH 3,5. </li><li> Zentrifugieren Sie die Töpfe in einen Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge bei 8.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Sobald die Zentrifuge stoppt, entfernen Sie vorsichtig die Zentrifuge Töpfe aus der Zentrifuge. </li><li> Sehr gently abgießen und den Überstand verwerfen. Folgen Sie geeignete Maßnahmen zur infektiösem Material. </li><li> Add 7 ml Phosphatpuffer, um das Pellet in jede Zentrifuge Flasche zu lösen. </li><li> Nachdem die Flocken aufgelöst haben, messen und fügen Phosphatpuffer auf ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erreichen. </li><li> Homogenisieren der viralen Konzentrat durch Vortexen und verteilen die 10 ml in ein sauberes Röhrchen, die bei -80 ° C sollte bis zum Gebrauch in die weitere Analyse. </li></ol></li></ol> 2. Nukleinsäure-Extraktion <ol><li> Führen Sie eine Nukleinsäure-Extraktion mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Dieses Kit ermöglicht die Verwendung eines automatisierten Plattform (wie QIAcube, Qiagen). </li></ol> 3. Quantitative PCR von humanen Adenoviren (HAdV), JC Polyomaviren (JCPyV), Schwein Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) <ol><li> Die Quantifizierung der Genom-Kopien in den Proben <ol><li> Vorbereitender qPCR Mix in einem sauberen separaten Bereich mit TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Die Reaktion findet in einem 96-Loch-optische Reaktion Platte mit optischer Kleber abdeckt. Die Konzentrationen der Master Mix, sind Primer und Sonden in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Sobald die Mischung hergestellt wurde, aliquoten 15μl in jede Vertiefung, einschließlich der Kontrollen (siehe 3.2). Das Gesamtvolumen für eine Reaktion nach Zugabe von Ziel wird es sein 25 &amp;mgr; l (15μl Mix + 10 &amp;mgr; l Probe oder Standard). </li><li> Fügen Sie die Nukleinsäure-Extraktionen aus den Proben (10 &amp;mgr; l) in einem separaten Bereich. Run direkte und eine zehnfache Verdünnung in gereinigtem Wasser von jeder Probe in zweifacher Ausfertigung. Decken Sie die Vertiefungen mit den Proben mit einem Teil eines Klebstoffes decken, halten die anderen Teil der Abdeckung für den folgenden Schritt. </li><li> Add Verdünnungen der DNA-Standard-Suspensionen (10 &amp;mgr; l) von 10 0 bis 10 6 GC/10μl von dreifacher Ausfertigung und mit einer Mikropipette ausschließlich für den stan verwendetdard-DNA. Es ist ratsam, die Standards in einem Gebiet mit UV-Strahlung für die Zerstörung Plasmid-DNA und der Mikropipette nach jedem Gebrauch gereinigt ausgestattet hinzuzufügen. Decken Sie die Vertiefungen mit den Standards der pre-cut Klebstoff zu decken. Hinweis: Um Standard-Suspensionen in der Quantifizierung der Genom-Kopien verwendet werden vorbereitet, sollte der Ziel-DNA Region in ein Plasmid und linearisierte geklont werden. In der folgenden Adresse finden Sie eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens, wie man Standard-Kurven mit Plasmid-DNA-Templates in qPCR eingesetzt werden zu erstellen: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li> Führen Sie die qPCR in ein angemessenes System der Auswahl der geeigneten Parameter (unter Berücksichtigung der Verwendung von Klebstoff Abdeckung und das Gesamtvolumen in jede Vertiefung, etc). Nach der Aktivierung der AmpliTaq Gold für 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen der Amplifikation sind wie folgt durchgeführt: 15 s bei 95 ° Cund 1 min bei 60 ° C für HAdV, JCPyV und BPyV und 15 s bei 95 ° C, 20s bei 55 ° C und 20s bei 60 ° C für PAdV. </li><li> Sobald die Reaktionen abgeschlossen sind, verwendet Daten speichern und die Ergebnisse wie in der Bedienungsanleitung des Gerätes beschrieben. Die DNA-Menge wird als der Median der Daten nach der Korrektur der Verdünnungsfaktor bei Bedarf erhalten definiert werden. </li></ol></li><li> Steuerung <ol><li> Verwenden Sie positive und negative Kontrollen. Der Test muss mehr als eine Nicht-Template (NTC) zu beweisen, Mix produziert keine Fluoreszenz. Es ist ratsam, den positiven Prozess-Steuerung laufen lassen, um mögliche enzymatische Hemmung durch Inhibitoren, die in den untersuchten Proben zu bewerten. </li><li> Rekordergebnis von qPCR-Assays von zwei verschiedenen Verdünnungen der Standard-DNA und von der Prozess-Steuerung. Verwenden Ergebnisse Regelkarten für die Qualitätskontrolle (QC)-Programme im Zusammenhang mit der Sensitivität und Effizienz des Tests vorzubereiten. </li></ol></li><li> Bestätigung derErgebnisse <ol><li> Positive Ergebnisse können weiter bestätigt werden mittels nested-PCR-und Nukleotid-Sequenzierung der Amplifikate, produziert zusätzliche Daten über die Nukleotidsequenzen der Stämme nachgewiesen 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> Nach der beschriebenen Vorgehensweise haben menschlichen und tierischen Viren nachgewiesen und quantifiziert in Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser 2,3. Als repräsentatives Beispiel wurden Grundwasserproben aus den Bereichen präsentiert ein hohes Maß an Nitraten ausgewertet, um die Quellen der Verunreinigungen zu definieren. Zehn-Liter-Wasser-Proben wurden aus 4 verschiedenen Brunnen in ländlichen Gebieten der Nordost-Region in Spanien gesammelt. Fünf Wiederholungen wurden in jede Vertiefung wird ein Replikat mit humanen Adenovirus 2 als Prozesskontrolle eingesetzt ausgesät gesammelt. Die Proben wurden nach dem Protokoll in Abbildung 1 dargestellt verarbeitet. Die vier Wiederholungen analysiert in einem der vier Standorte untersucht zeigten positive Ergebnisse für PAdV (Mittelwert 7,74x10 2 GC / L), die auf das Vorhandensein von Schweine-Schlämmen in den Bereichen rund um die Probenahme vor Ort bezogen sein würde und würde fäkale Kontamination Schweine als Quelle von Nitraten in das Grundwasser (Tabelle 2) zu unterstützen. 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Viren im Wasser. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Konzentration der Primer und Sonden für die qPCR-Assays. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="Tabelle 3" /> Tabelle 2. Erkennung und Quantifizierung von tierischen und menschlichen Adenoviren und Polyomaviren in Grundwasserproben. n Anzahl der Wiederholungen analysiert % Anteil der positiven repliziert (-) Nicht erkannt

<ol>
	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

Zwei Patentanmeldungen wurden 2009 eingereicht, um das geistige Eigentum von Protokollen für die Quantifizierung der PAdV und BPyV schützen.

<html> Die beschriebene Vorgehensweise würde die Voraussetzungen für eine passende Methode für den Routineeinsatz Umwelt und öffentliche Gesundheit Laboratorien: reproduzierbar, zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig. Das Protokoll ist einfach, aber es müssen unbedingt beachtet werden. Niedrige Leitfähigkeit in den Proben ohne Zugabe von der angeforderten Konzentration von künstlichem Meerwasser Salze würden drastisch reduzieren die Wiederherstellung von Viren wie der Fall wäre, wenn die Rührzeit zur Fl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> High-Speed-Zentrifuge (8.000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-Meter, Thermometer und Konduktometer </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffrohre 100-200 cm Länge </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile absolvierte Einwegpipetten </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Plastikröhrchen von 1,5 und 10-15 ml (Eppendorf, Falken, etc.) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge Töpfe (500 mL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetrührer und Magneten (eine proProbe) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> Glas-oder Kunststoffbehältern mit flachem Boden, die Nutzung der Magnetrührer ermöglichen </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Eine peristaltische Pumpe zum Entfernen des Überstandes (oder ein Wasser-Strahl-Vakuumpumpe) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Timer zum Abschalten des Rühren nach 8-10 Stunden </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> Salzsäure (1 N und 0,1 N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid (1 N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Künstlichem Meerwasser Meersalz </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatpuffer pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 1:2 v / v steriler Na 2 HPO 4 0,2 M NaH 2 PO 4 0,2 M bei pH 7,5 </td></tr><tr><td> Thiosulfat </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Machen Sie eine 10% ige Lösung in Wasser </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-optische Reaktion Platte (500 Einheiten) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Optische Abdecktüchern (100 Einheiten) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

Mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt eine erhebliche Gesundheitsgefahr. Klassische bakterielle fäkalen Indikatoren haben gezeigt, dass erhebliche Einschränkungen haben, sind Viren resistenter gegen viele Inaktivierung Prozesse und Standards fäkalen Indikatoren nicht auf die Quelle der Verunreinigung zu informieren. Die Entwicklung von kosteneffizienten Methoden für die Konzentration der Viren aus dem Wasser und molekularen Assays ermöglicht die Anwendbarkeit von Viren als Indikatoren für fäkale Verunreinigungen und mikrobiellen Quelle Tracking (MST)-Tools. Adenoviren und Polyomaviren sind DNA-Viren infizieren bestimmten Wirbeltierarten einschließlich des Menschen und werden dauerhaft in Kot und / oder Urin in allen geografischen Gebieten studiert ausgeschieden. In früheren Studien, schlugen wir die Quantifizierung von humanen Adenoviren (HAdV) und JC Polyomaviren (JCPyV) durch quantitative PCR (qPCR) als Index für die menschliche fäkale Verunreinigungen. Vor kurzem haben wir qPCR-Assays für die spezifische Quantifizierung von por entwickeltcine Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) als tierische Fäkalien Marker der Kontamination mit Empfindlichkeiten von 1-10 Genom Kopien pro Reagenzglas. In dieser Studie stellen wir die Verfahren, nach dem die Quelle der Kontamination in Wasserproben mit diesen Tools zu identifizieren. Als Beispiel für repräsentative Ergebnisse, ist die Analyse der Viren im Grundwasser stellt ein hohes Maß an Nitraten gezeigt. Nachweis von Viren in niedrig oder mäßig verschmutztes Wasser erfordert die Konzentration der Viren von mindestens mehrere Liter Wasser in einem viel kleineren Volumen, ein Verfahren, das in der Regel umfasst zwei Schritte Konzentration in Serie. Diese etwas umständliche Prozedur und die Variabilität der viralen Erholungen zu beobachten wesentlich erschweren die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Wasserproben. Zur Beseitigung des Engpasses durch die Zwei-Schritt-Verfahren verursacht haben wir in einem Schritt-Protokoll in den vergangenen studie entwickelt beantragt haben,s und für eine Vielfalt von Wasser-Matrizen. Das Verfahren umfasst: Versauerung der Zehn-Liter-Wasser-Proben, Flockung von Magermilch, Schwerkraftsedimentation der geflockten Materialien, Sammlung des Niederschlags und Zentrifugation, Resuspension des Niederschlags in 10 ml Phosphat-Puffer. Die virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse sind, durch qPCR quantifiziert werden. Hohe Anzahl von Proben können gleichzeitig analysiert werden mit dieser Low-Cost-Konzentration Methode. Das Verfahren ist auf die Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet, und bei dieser Studie präsentieren wir Ergebnisse der Analyse Grundwasserproben. Diese High-Throughput-quantitative Methode ist zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig.

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Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.

Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

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Serie: Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

Umfassende &amp; Kostengünstig Laboratory Überwachung von HIV / AIDS: eine afrikanische Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...