Wir danken der Wistar Institute Tierhaltung, Microscopy Facility, Histotechnology Facility und Forschung Supply Center. Diese Studie wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health CA 076674, CA 098101, 025874 und CA CA 10815 finanziert.

1. Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Model: <ol><li> Vorbereitung der azelluläre Schicht: Mischen Sie die folgenden Reagenzien in einem 50 ml-Röhrchen auf Eis: 0,59 ml 10x EMEM, 50 ul 200 mM L-Glutamin, 0,6 mL FBS, 120 ul 7,5% Natriumbicarbonat und 4,6 mL Rinder-Kollagen I. 1 mL Die Mischung in jeder Einsatz der Gewebekultur Tabletts. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur und damit das Gel zu erstarren. Farbe der Mischung sollte aus Stroh-gelb bis pink werden. </li><li> Trypsinize menschlichen Fibroblasten aus Kulturflaschen mit 0,25% Trypsin / EDTA, fügen DMEM mit 10% FBS zu neutralisieren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und Resuspendieren 0,45 x 10 6 Zellen in 1,5 ml DMEM mit 10% FBS. Für die dermale Stammzellen sammeln 6600 dermal Kugeln (wenn dermale Stammzellen in Stammzell-Medium wachsen, bilden sie Kugeln in einer ähnlichen Weise wie Neurosphären), indem Sie auf Kolben auf die Kugeln, Zentrifugation zu trennen. </li><li> Vorbereitung der zellulären Ebene: Mischen Sie die folgenden in einer 50 ml-Röhrchen auf Eis: 1,65 ml 10x EMEM, 150 ul 200 mM L-Glutamin, 1,85 mL FBS, 350 ul 7,5% Natriumbicarbonat, 14 mL Rinder-Kollagen I und 1,5 mL Fibroblasten Aufhängung von Schritt 2 (alternativ verwenden Kombination von 0,45 x 10 6 Fibroblasten und 6600 dermal Kugeln in 1,5 ml der Haut zu rekonstruieren Medium I zur dermalen Stammzellen rekonstruiert), gut mischen. Add 3 mL der Mischung auf jeden azelluläre Schicht beschichtet einzufügen. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator. Farbe der Mischung sollte aus Stroh gelb bis pink werden. Nachdem das Gel erstarrt, fügen DMEM mit 10% FBS (2 mL innen und 10 mL außerhalb des Einsatzes in jede Vertiefung der Haut zu rekonstruieren Trays). Inkubieren für 4 Tage und stellen Sie sicher, dass das Gel Verträge. </li><li> Absaugen Medium von innen und außen jedes Einsatzes. Add Waschmedium (HBSS mit 1% dialysiert FBS) 2 mL nach innen und 10 mL nach außen zu legen um abwaschen regelmäßige Serum. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Vorbereitung der Haut zu rekonstruieren Medium: <ol><li> Für den normalen Melanozyten und dermalen Stammzellen rekonstruiert: Um Basismedium (500 mL) zu machen, mischen die folgenden Reagenzien: 490 ml Keratinozyten-serum-freiem Medium, 1,8 ml Rinder-Hypophysen-Extrakt, 10 ml dialysiert Rinderfötenserum, 500 ul von 10 pg / mL SCF, 562,5 ul 4 pg / mL bFGF und 500 ul von 264 pg / mL ET-3. Medium I: Fügen Sie 10 ul EGF von 100 ug / ml bis 100 ml Basismedium. Medium II: In 2 ul EGF auf 100 ml Basismedium. Medium III: In 720 ul CaCl 2 von 1 M bis 300 ml Basismedium. </li><li> Für Melanome der Haut zu rekonstruieren: Um Medium I (100 mL), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM), 2 ml L-Glutamin von 200 mm, 200 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 200 ul ITES von 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 200 ul Adenin von 90 mm, 200 ul Progesteron von 2 nM, 240 ul CaCl 2 von 1 M, 200 ul Trijodthyronin von 10 nM und 100 ul chelexed Neugeborenen Kälberserum (löst 3 g Chelex 100 in 100 ml Serum, rühren 1,5 Stunden bei 4 ° C, Filter sterilisieren). Um Medium II (100 mL), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM), 2 ml L-Glutamin von 200 mm, 200 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 200 ul ITES von 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 200 ul Adenin von 90 mm, 200 ul Progesteron von 2 nM, 240 ul CaCl2 von 1 M, 200 ul Trijodthyronin von 10 nm und 100 ul Neugeborenen Kälberserum. Um Medium III (300ml), mischen Sie die folgenden Reagenzien: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM), 6 ml L-Glutamin von 200 mm, 600 ul Hydrocortison von 269 g / mL, 600 ul ITES von 500X , 600 ul O-phosphorylethanolamine von 0,05 M, 600 ul Adenin von 90 mm, 600 ul Progesteron von 2 nM, 720 ul CaCl 2 von 1 M, 600 ul Trijodthyronin von 10 nm und 6 mL Neugeborenen Kälberserum. </li></ol></li><li> Trypsinize humanen Keratinozyten aus Kulturflaschen mit 0,05% Trypsin / EDTA, neutralisieren Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor (250 mg / L in 1x phosphate buffered saline), Spin-Down, resuspendieren ein Zellpellet in 4,17 x10 6 Zellen / ml in der Haut zu rekonstruieren Medium I. </li><li> Trypsinize menschlichen Melanozyten oder Melanomzellen aus Kulturflaschen mit 0,05% Trypsin / EDTA, neutralisieren Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor, Spin-Down, resuspendieren ein Zellpellet bei 0,83 x10 6 Zellen / ml in der Haut zu rekonstruieren Medium I. </li><li> Entfernen Spülmedium von innen und außen jedes Einsatzes. </li><li> Add Haut zu rekonstruieren Medium I (1,5 ml nach innen und 10 mL auf der Außenseite jedes insert). </li><li> Nehmen Sie 600 ul Zellsuspension von Keratinozyten und 600 ul Zellsuspension von Melanozyten oder Melanomzellen, gut mischen. Geben Sie 200 ul Zellsuspension gemischt Tropfen für Tropfen an der Innenseite jedes Einsatzes. Für die dermale Stammzellen zu rekonstruieren, nutzen 100 ul der Keratinozyten-Suspension nur. Inkubieren für 2 Tage bei 37 ° C. </li><li> Absaugen der Haut zu rekonstruieren Medium Isowohl aus dem Inneren und dem Äußeren eines jeden einzufügen. Add Haut zu rekonstruieren Medium II (2 mL nach innen und 10 mL nach außen). Inkubieren für weitere 2 Tage bei 37 ° C. </li><li> Absaugen der Haut zu rekonstruieren Medium II von innen und außen jedes Einsatzes, fügen Sie 7,5 ml Haut zu rekonstruieren Medium III, um nur die Außenseite. Ab diesem Zeitpunkt rekonstruiert die Oberfläche beginnt zu der Luft ausgesetzt. Ändern Medium III jeden zweiten Tag bis zum Tag 18. </li><li> Ernte Haut an Tag 18 zu rekonstruieren: <ol><li> Saugen Sie Medien aus dem Inneren und dem Äußeren der Einsätze. </li><li> Entfernen Einsätze aus Fach mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie die zu rekonstruieren (einschließlich der Polycarbonat-Filter) durch Verfolgung eines Kreises nahe an den Rand mit einem Skalpell. </li><li> Schneiden Sie die Rekonstruktion und den Filter in der Hälfte auf eine harte Oberfläche. </li></ol></li><li> Für Paraffinschnitte: Ort der Hälfte der in einem histologischen Kassette zwischen 2 schwarz TBS Biopsie Papiere zu rekonstruieren und genießen das ganze Kassette in 10% Formalin für mehr als 4 Stunden. Dann legen Sie die Kassette in 70% Ethanol und speichern Sie sie bei 4 ° C, bis Sie bereit sind, die für Paraffineinbettung rekonstruieren zu verarbeiten. </li><li> Für Gefrierschnitte: <ol><li> Legen Sie die andere Hälfte zu rekonstruieren in 50% Saccharose bei 4 ° C für 1-2 Stunden, dann ändern Sie die Saccharose zu 2M und speichern Sie sie bei 4 ° C für weitere 1-2 Stunden. </li><li> Dispense optimale Schnittqualität Temperatur dem Gefrierpunkt Medien (OCT) in eine Einweg-Bodenform, so dass es etwa 50% des Bootes füllt. Vermeiden Sie Luftblasen im Oktober </li><li> Besorgen Sie sich die Kante der mit einer Pinzette zu rekonstruieren und entfernen Sie die aus der Saccharose zu rekonstruieren. Legen Sie sie auf Kimwipes bis Kimwipes der Saccharose zu absorbieren. </li><li> Übertragen Sie die in der Basisform auf der OCT zu rekonstruieren, mit einer Pinzette und einem Spatel. Decken Sie die Oberseite des mit mehr Okt rekonstruieren, bis die Basisform vollständig gefüllt ist. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in den ÜLG, die machen das Schneiden schwieriger wird. </li><li> Stellen Sie die Basisstation Form gleichmäßig auf zerstoßenem Trockeneis, und ermöglichen den ÜLG vollständig einfrieren. </li><li> Wickeln Sie das Basis-Werkzeug in Alufolie und speichern Sie es bei -70 ° C bis Sie bereit sind, es mit einem Kryostaten geschnitten werden. </li></ol></li><li> Graft eine Haut einer Maus zu rekonstruieren: <ol><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml DMEM (zum Einfrieren und Auftauen der Haut von Mäusen). </li><li> Verwenden Sie einen weiblichen SCID haarlosen Maus outbred rund 6 Wochen. </li><li> Die Maus ist mit Isofluran (EZ Anästhesie-System): initial Anästhesie ist in der Induktion Kammer mit 4% Isofluran (vor Maus, um die chirurgische Bett bewegt wird) und zu pflegen Narkose durch eine nosecone Verschnaufpause während des Eingriffs durchgeführt (Isofluran: 1.5-2% ). Hitze Unterstützung durch ein Heizkissen auf Unterkühlung und sterile ophthalmologische Gleitmittel aufgetragen zu verhindern Augenverletzung während der Narkose zu verhindern. </li><li> Setzen Sie 600 mL Wasser in ein Becherglas und lassen Sie auf einer heißen Platte, um die Wassertemperatur zwischen 40 halten - 60 ° C. </li><li> Reinigen Sie die Haut von Mäusen mit Verbindung Benzoin-Tinktur und Alkohol prep Tupfer. </li><li> Mark eine Linie auf der Oberseite der Maus wieder auf die gleiche Position zum Nähen später zu halten. </li><li> Schneiden Sie einen runden Wundbett ca. 1,2 cm im Durchmesser auf der Maus den oberen Rücken mit Iris Schere und Pinzette. Bedecken Sie die Wunde Bett mit steriler Gaze Schwämme. Legen Sie die runde Haut von Mäusen in 5 ml DMEM, dann in flüssigem Stickstoff zu verlassen, bis es gefroren völlig. Defrost das Rohr in heißem Wasser auf einer heißen Platte, bis völlig aufgetaut. Wiederholen Sie die 3-fache. </li><li> Lösen Sie die Haut vor dem Transwell mit Skalpell zu rekonstruieren und entfernen Sie die Membran sehr vorsichtig, übertragen Sie die Haut zu rekonstruieren (Epidermis nach oben) auf der Oberseite des Wundbett. </li><li> Platzieren Sie die Maus Haut (Epidermis nach oben) auf der Haut zu rekonstruieren. </li><li> Sprechen Sie die erste Naht auf die Markierung zuvor angegeben, die auf dem Boden, dann noch zwei weitere Nähte an den Seiten, um die Haut von Mäusen zu beheben. </li><li> Reinigen Sie die Haut von Mäusen nach der Transplantation. Entfernen nosecone und halten Sie die Maustaste auf dem Heizkissen bis wach und gehfähig. </li><li> Legen Sie die Maus in einen neuen Käfig. </li><li> Postoperative Analgesie: Meloxicam (1 mg / kg) durch subkutane Injektion sofort nach der Operation, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Operation. </li></ol></li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse: Haut rekonstruiert mit normalen Melanozyten und dermalen Stammzellen Die Haut rekonstruiert werden in einem speziellen 6-well Schale mit Einsätzen kultiviert. Die dermale Kompartiment ist in DMEM mit 10% FBS für den ersten vier Tagen (Abb. 1A) kultiviert. Die Haut rekonstruieren Medium I wird verwendet, wenn Keratinozyten mit Melanozyten oder Melanomzellen (Abb. 1B) ausgesät werden. Die Epidermis ist die Luft am Tag 9 ausgesetzt und dies ermöglicht Keratinozyten zu unterscheiden (Abb. 1C). Am Tag 18, rekonstruiert die Epidermis der Haut ist der geschichtete Keratinozyten Schichten. Die undifferenzierten basalen Schicht und nacheinander differenzierten Schichten sind vertikal orientiert (Abb. 1D). FleckIng. dem Abschnitt rekonstruiert mit den melanozytären Marker S100 zeigt, dass Melanozyten in der basalen Schicht der Epidermis und die Kommunikation mit mehreren Keratinozyten durch Dendriten-Erweiterungen (Abb. 1E) ausgerichtet sind. Die dermale Kompartiment enthält Fibroblasten in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet. Hinterlegt Kollagen IV zeigt die Basalmembran, die die Epidermis trennt sich von der Dermis (Abb. 1F). Wenn die Haut Stammzellen (beschriftet mit GFP lentiviralen Vektor) mit Fibroblasten in einer Kollagen I-Matrix eingebettet sind, sie auf die Epidermis migrieren und differenzieren sich in Melanozyten (1), (Abb. 2). Mehrere Schichten von Keratinozyten der Epidermis entwickelt. Haut rekonstruiert der Melanom-Tumoren Klinisch Studien zeigen, dass Melanome Fortschritte stufenweise: gemeinsame erworbenen Nävi, dysplastische Nävi, RGP (radial Wachstumsphase) Melanome, VGP (vertikale Wachstumsphase) Melanome und metastasierten Melanomen (7). Verschiedene Stadien der Melanom-Zelllinien sind morphologisch ähnlich zueinander in 2-D-Kultur (Abb. 3A-D), aber wenn sie in der Haut rekonstruiert eingebaut sind, spiegelt das Verhalten der Zellen ihre in vivo Eigenschaften. Die Lage und das Wachstum von normalen Melanozyten sind fest in der Haut rekonstruiert (Abb. 3E) gesteuert. RGP primären Melanome WM35 vermehren überwiegend in der Epidermis (Abb. 3F), während VGP Melanome WM793 invasiv wachsen in die Dermis (Abb. 3G). Metastasierten Melanomen 1205Lu aggressiv tiefen Invasion in die Dermis (Abb. 3H). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Abbildung 1. Haut rekonstruiert mit normalen Melanozyten. Die Bruttomarge des Hautbildes rekonstruiert wird in AC dargestellt. A. Fibroblasten mit Kollagen vermischt werden in DMEM mit 10% FBS und Form dermale Fach gewachsen. B. Keratinozyten und Melanozyten sind oben auf der Dermis ausgesät und wachsen in der Haut zu rekonstruieren Medium. C. Die Epidermis ist die Luft am Tag 9 ausgesetzt. D. H &amp; E-gefärbten Haut zu rekonstruieren präsentiert die Epidermis umfasst vertikal orientierten basalen Schicht und nacheinander differenziert geschichtet Zellschichten. Die Dermis enthält Fibroblasten in einer Kollagen-Typ-I-Matrix eingebettet. E. S100-positive Melanozyten (schwarze Pfeile) sind an der Basalmembran und die Kommunikation mit mehreren Keratinozyten ausgerichtet. F. Collagen IV-Färbung zeigt die Basalmembran, die die Epidermis trennt sich von der Dermis. Alle Färbungen in DF wurden auf Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete Schnitte durchgeführt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dermal Stammzellen in der Haut rekonstruiert migrieren, um die Epidermis und differenzieren sich in Melanozyten. Am Tag 5 nach der Aussaat Keratinozyten, einzelne GFP-positive Zellen (grün) wandern aus Sphären zu beginnen. Die Epidermis ist noch aus einer einzigen Schicht besteht. Am Tag 8, erreichen ein paar Zellen der Epidermis-Dermis-Schnittstelle. Am Tag 10, GFP-positiven Zellen dicht an der Basalmembran Position ausgerichtet. Die migrierten GFP-positive Zellen in der Epidermis zum Ausdruck melanozytären Marker HMB45 (rot, dargestellt durch weiße Pfeile). Zellkerne sind mit DAPI (blau) gefärbt. Die Epidermis ist als mehrere Schichten entwickelt. Die Basalmembran ist mit weißen gepunkteten Linien angedeutet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Abbildung 3. Haut rekonstruiert der verschiedenen Stadien des Melanoms: AD. Normale Melanozyten und Melanomzellen in 2D Kulturen aufgewachsen. A. Melanozyten aus Vorhaut. B. RGP WM35-Zellen. C. VGP WM793-Zellen. D. metastasierendem Melanom 1205Lu Zellen. E. Normale Melanozyten sind an der Basalmembran befindet. F. RGP Melanom WM35 Zellen wachsen als Zellhaufen in der Epidermis. G. VGP Melanom WM793 Zellen eindringen in die Dermis durch Basalmembran. H. metastasierendem Melanom 1205Lu Zellen aggressiv in in Dermis tief. Fehlerbehebung <table border="1"><tbody><tr><td> Problem </td><td> Fehlerbehebung </td></tr><tr><td> Collagen Gemisch nicht erstarren </td><td> Collagen Mischung Farbe sollte Stroh-gelb bis pink, sonst pH falsch und Kollagen kann nicht gel. Wenn die Farbe ist leuchtend gelb, sollte mehr Natriumbicarbonat tropfenweise hinzugefügt werden. </td></tr><tr><td> Collagen vorzeitig fällt in der mixuture </td><td> Halten Sie alle Komponenten auf Eis, bis die Kollagen-Gemisch auf den Einsatz platziert ist </td></tr><tr><td> Vertraglich Kollagen ist nicht einmal (eine Seite ist dicker als die andere Seite) </td><td> Kalibrieren Sie das Regal mit Inkubator </td></tr><tr><td> Die Epidermis ist mit weniger als drei Keratinocytenschichten gebildet. </td><td> Verwenden Sie undifferenzierten Keratinozyten bei niedrigeren Passagen </td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben beschrieben, Erzeugung von 3D-Haut rekonstruiert mit normalen humanen Melanozyten, dermalen Stammzellen und Melanomzellen. Wenn in Monolayer-Kultur gewachsen, präsentieren melanozytären Zellen eine ähnliche Morphologie (abgeflacht, Spindel oder mehr dendritische-förmig) unabhängig von ihrer Herkunft von klinischen Stadium. Im Gegensatz dazu rekonstruiert 3D Haut rekapitulieren stage-spezifischen Eigenschaften von Melanomzellen. Normale menschliche Melanozyten an der Basalmembranen zwischen den epidermalen und dermalen Schichten als einzelne Zellen befinden. RGP primären Melanomzellen wachsen als kleine Cluster entlang der Basalmembran, während mehr aggressive VGP Melanomzellen als große Cluster Durchbrechen der Basalmembran in die Dermis zu wachsen. Metastasiertem Melanom-Zellen in allen Richtungen wachsen und dringen tief in die Dermis als einzelne Zellen oder Cluster. Quantitative Analysen können bei diesem Modell durch die Messung der Tiefe der Invasion und dem Ausmaß der Verbreitung durchgeführt werden. Zusätzlich zu Charakterisierung von normalen und malignen melanozytären Zellen unter Verwendung des Musters können wir direkt induzieren die Differenzierung der Haut Stammzellen zu reifen Melanozyten, die Heimat der basalen Schicht der Epidermis und bona fide Kommunikation mit Keratinozyten zu etablieren durch Hochregulation von E-Cadherin ( 6). Mit viralen Vektoren, sind wir in der Lage, entweder aktivieren oder inaktivieren Genfunktionen für ein besseres Verständnis der Dynamik und funktionelle Bedeutung von Genen von jedem Zelltyp in der Haut exprimiert rekonstruiert, die ein effizientes Modell, um nicht nur Transformation Mechanismen der Melanozyten-Studie zu werden verspricht , aber auch Fortschreiten des Melanoms (8). Langfristige Beobachtung der Zellphänotypen geworden durch Pfropfen von Haut rekonstruiert, um immundefizienten Tieren möglich. Eine solche menschliche Haut-Maus-Chimäre ist ein hervorragender Forschungs-Tool, um melanomagenesis und Melanom Metastasen zu untersuchen. Haut rekonstruiert kann auch eine nützliche Plattform für Drogen-Bewertung. Viele Medikamente, die Krebszellen in 2D Kulturbedingungen zu beseitigen haben oft wenig Wirkung in experimentellen und klinischen Anwendungen. Wie in gesehen das in vivo Tumoren sind Melanomzellen in 3D-Kulturen häufig resistent gegen die Medikamente, die Zellen in 2D Kulturen zu reagieren, was darauf hindeutet, dass die Mikroumgebung Signalwegen moduliert in Melanom. Für eine erfolgreiche Wirkstoffentwicklung, rekonstruieren die 3D-Hautmodell ist ein ideales Werkzeug, um die präklinische Wirkungen von Verbindungen in vivo (9,10) vorherzusagen. Zusammenfassend rekonstruieren Hautmodelle die Kluft zwischen in vitro und in vivo Studien. Sie werden zu einem besseren Verständnis, welche Gene in Transformation und wie Stammzellen beteiligt sind, führen dazu beitragen, dass die Transformation.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 10x EMEM </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.071,02 </td></tr><tr><td> Rindersehne Säure extrahierten, Collagen </td><td> Organogenesis </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Tissue Culture 6-well Trays mit Inserts </td><td> Organogenesis </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Keratinocyte serumfreien Medium </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Dialysiertem fetalen Kälberserum </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.079,03 </td></tr><tr><td> rekombinanten humanen Stammzellen Factor </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> RDI-307-255x </td></tr><tr><td> Grundlegende FGF </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> Endothelin-3, menschliche </td><td> American Peptide Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH Biowissenschaften </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> Insulin, Transferrin, Ethanolamin, Selenium (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Trijodthyronin </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Newborn Kälberserum </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% Puffer Formalin </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Optimale Schnittqualität Temperatur dem Gefrierpunkt Medien (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Multi-Kassetten </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS Biopsie Papiere </td><td> Triangle Biomedical Sciences </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS Biopsie Papiere </td><td> Triangle Biomedical Sciences </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Einweg Bodenformen </td><td> Fischer </td><td> 15 bis 182-501C </td></tr><tr><td> Compound Benzoin-Tinktur </td><td> Professionelle Disposables, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Alcohol Prep Swabs </td><td> CVS-Apotheke </td><td></td></tr><tr><td> Silk schwarz geflochten 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Gaze-Schwamm (steril) </td><td> CVS-Apotheke </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris Schere </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Chirurgische Klingen </td><td> Feder </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ Anästhesie </td><td> Euthanex Corp </td><td></td></tr><tr><td> SCID haarlosen Maus outbred </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

Die meisten in-vitro-Studien in der experimentellen Biologie der Haut haben in 2-dimensionale (2D) Monokulturen getan worden, während mehrenden Anzeichen darauf hin, dass Zellen sich anders verhalten, wenn sie innerhalb einer 3D-extra-zelluläre Matrix angebaut werden und auch die Interaktion mit anderen Zellen (1-5) . Mausmodelle wurden weitgehend genutzt werden, um Gewebemorphogenese in-vivo-Studie. Allerdings Maus und der menschlichen Haut haben signifikante Unterschiede in der zellulären Architektur und Physiologie, die es erschweren, Maus-Studien auf den Menschen extrapolieren lässt. Da Melanozyten in der Haut von Mäusen vor allem in den Haarfollikeln lokalisiert sind, haben sie unterschiedliche biologische Eigenschaften von denen des Menschen, die in erster Linie an der basalen Schicht der Epidermis zu finden. Die jüngste Entwicklung von 3D-Modellen menschlicher Haut zu rekonstruieren ist das Feld, um Zell-Matrix-und Zell-Zell-Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen untersuchen aktiviert. Die rekonstruiert bestehen aus einem &quot;Lederhaut&quot; mit Fibroblasten in einer Kollagen I-Matrix, eine &quot;Epidermis&quot;, die aus geschichteten, differenzierten Keratinozyten und eine funktionelle Basalmembran, die Epidermis trennt sich von Dermis umfasst eingebettet ist. Collagen stellt Gerüste, Nährstoffzufuhr und das Potenzial für Zell-Zell-Interaktion. Die 3D-Modelle mit Haut melanozytären Zellen rekapitulieren natürlichen Eigenschaften von Melanozyten-Homöostase und Melanom Progression in der menschlichen Haut. Wie in vivo, sind Melanozyten in rekonstruierter Haut an der Basalmembran mit basalen Schicht Keratinozyten durchsetzt lokalisiert. Melanom-Zellen weisen die gleichen Merkmale, die die ursprüngliche Tumorstadium (RGP, VGP-und metastasierendem Melanom-Zellen) in vivo. Vor kurzem haben dermale Stammzellen im menschlichen Dermis (6) identifiziert worden. Diese multi-potenten Stammzellen der Epidermis migrieren und differenzieren zu Melanozyten.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

In diesem Bericht beschreiben wir die dreidimensionale Rekonstruktion der Haut Modell, das die menschliche Haut imitiert in der Architektur und Komposition. Melanozyten Physiologie, Melanom Progression und das Schicksal der dermalen Stammzellen untersucht worden mit der Haut zu rekonstruieren Modell. Das Modell ist auch nützlich als Werkzeug für die präklinische Arzneimittel Beurteilung.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K Aufrufe.  The Wistar Institute. In diesem Bericht beschreiben wir die dreidimensionale Rekonstruktion der Haut Modell, das die menschliche Haut imitiert in der Architektur und Komposition. Melanozyten Physiologie, Melanom Progression und das Schicksal der dermalen Stammzellen untersucht worden mit der Haut zu rekonstruieren Modell. Das Modell ist auch nützlich als Werkzeug für die präklinische Arzneimittel Beurteilung.

Serie: The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Forschung

Biotechnik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Untersuchung der dreidimensionalen Strömungstrennung, die durch ein Modell Vocal Fold Polyp induziert wird

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...