Die in diesem Protokoll enthaltenen Details behandeln die äquivalente Erzeugung menschlicher Haut, die oft technisch anspruchsvoll ist. Neuartige äquivalente Protokollelemente der menschlichen Haut, wie Vaskulatur und volumetrische Bildgebung, sind enthalten. Die Technik ermöglicht die einfache Konstruktion eines Hautmodells, das in-vivo-Gewebe für die Untersuchung von Krankheiten, Alterung und personalisierter Medizin enger zusammenpasst.
Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist der Übergang zwischen Tauch- und Luft-Flüssig-Schnittstelle. Es wird wahrscheinlich ein paar Versuche dauern, um das Timing und die Medienebenen für konsistente Ergebnisse zu optimieren. Um zu beginnen, fügen Sie 516 Mikroliter Medien zu einem kalt verschlossenen Röhrchen hinzu und fügen Sie sofort 375 Mikroliter kaltes Kollagen mit der 1000-Mikroliter-Verdrängerpipette hinzu.
Entfernen Sie die leere Pipettenspitze und wechseln Sie zum Mischen in die vorbereitete 250-Mikroliter-Verdrängerpipette. Mischen Sie schnell, aber sanft, um eine übermäßige Blasenbildung zu verhindern. Halten Sie die Spitze in der Lösung, mischen Sie gleichmäßig von verschiedenen Positionen des Rohres, bis die Lösung von homogener Farbe ist, was typischerweise etwa fünf Pipettenzyklen oder 10 Sekunden dauert.
Verteilen Sie sofort 125 Mikroliter azelluläres Kollagen auf die Membran des 12-Well-Kultureinsatzes. Um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten, neigen Sie die Platte und verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Membran zu bemalen, indem Sie Kollagen sanft verteilen. Bewegen Sie die 12-Well-Platte sofort in einen 37-Grad-Celsius-Zellkultur-Inkubator, um sie mindestens 20 Minuten gelieren zu lassen.
Nach der Gelationszeit nehmen Sie die 12-Well-Platte aus azellulärem Kollagen aus dem Inkubator. Entfernen Sie das 1,7 Milliliter-Kappenrohr aus nassem Eis, entfernen Sie dann das Brühekol aus der Kühlung und legen Sie es bei geöffnetem Deckel auf nasses Eis. 516 Mikroliter gekühlte Zellsuspension in das kalt verschlossene Rohr geben.
Verwenden Sie die 1000-Mikroliter-Pipette, um sofort 375 Mikroliter kalte Kollagenlösung direkt in die Lösung im verschlossenen Röhrchen zu pipetten. Das gesamte Kollagen aus der Pipette in das Röhrchen ausstoßen und die Verdrängerpipettenspitze verwerfen. Wechseln Sie sofort zur 250-Mikroliter-Pipette und mischen Sie die Kollagenlösung Nach dem Mischen 250 Mikroliter zelluläre Kollagenlösung auf die azellulären Kollagenträger im 12-Well-Kultureinsatz übertragen und dann die 12-Well-Platte in einen 37 Grad Celsius Zellkultur-Inkubator bewegen.
Nach der 30-minütigen Gelzeit neigen Sie die Platte vorsichtig, um die Gelierung zu beurteilen und stellen Sie sicher, dass das Kollagen verfestigt ist. 500 Mikroliter bzw. 1000 Mikroliter Mischmedien werden in die obere Kammer bzw. untere Kammer des Einsatzes gegeben. Stellen Sie sicher, dass das Kollagengel untergetaucht ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Medien hinzu.
Legen Sie die Well-Platte zur Inkubation über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am siebten Tag des Untertauchens eine manuelle Pipette, um Medien aus der unteren und oberen Kammer jedes Konstruktbrunnens zu sammeln und zu entsorgen. Um Medien zu sammeln, die direkt unter der durchlässigen Membran stecken, legen Sie die Pipettenspitze unter die Membran und schlagen Sie den Einsatz vorübergehend aus dem Platz.
Fügen Sie einen Milliliter menschliches Hautäquivalent oder HSE-Medium, ergänzt mit 5% FPS, in die untere Kammer jeder Vertiefung und 200 Mikroliter Zellsuspension in die obere Kammer jeder Vertiefung hinzu. Säen Sie die Keratinozyten direkt auf die Hautkonstruktoberfläche und lassen Sie sie zwei Stunden im Inkubator absetzen. Zwei Stunden nach der Aussaat der Keratinozyten fügen Sie vorsichtig 300 Mikroliter HSE-Medien hinzu, ergänzt mit 5% FPS in die obere Kammer jedes Konstruktbrunnens.
Nachdem Sie das Medium geladen haben, legen Sie das Konstrukt wieder in den Inkubator. Heben Sie jedes Konstrukt mit einer manuellen Pipette an seine Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI), indem Sie Nur Medienabfälle aus der oberen Kammer entfernen. Versuchen Sie, der epidermalen Schicht so nahe wie möglich zu kommen, ohne sie zu berühren oder zu beschädigen.
Neigen Sie die Platten leicht in verschiedenen Winkeln, um das Medium zu sammeln, und fügen Sie dann etwa zwei Milliliter steriles Wasser zu den umgebenden Brunnen in der Platte hinzu, um eine konstante Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Überprüfen Sie die Platte einige Stunden später, um sicherzustellen, dass sich die Keratinozyten noch am ALI befinden. Entfernen Sie alle Medien in der oberen Kammer und verfolgen Sie, wie viele Medien aus jedem Brunnen entfernt werden.
Die epidermalen Schichten sollten hydratisiert und nicht trocken aussehen, aber es sollten keine Medien auf dem Konstrukt gebündelt sein. Um das Konstrukt für die immunfluoreszierende Färbung vorzubereiten, drehen Sie einen Einsatz auf den Kopf und legen Sie ihn über seinen Brunnen auf die Bohrplatte. Stabilisieren Sie den Einsatz mit einer Hand, während Sie mit einer feinen Spitzenzette oder einem Präzisionsmesser etwa die Hälfte des Membranumfangs schneiden.
Schneiden Sie so nah wie möglich am Kunststoffgehäuse. Greifen Sie mit der Feinspitzenzette den Rand der geschnittenen Membranklappe und schälen Sie die poröse Membran vorsichtig vom Einsatz sowie vom VHSE-Konstrukt. Wenn das Konstrukt an der Seite der Kammer hängen bleibt, verwenden Sie die feine Spitzenzette oder eine kleine Schaufel, um es zum Brunnen zu bewegen.
Sobald sich die VHSE im Bohrplatz befindet, entsorgen Sie alle verbleibenden Teile der Einlegemembran und halten Sie das Kultureinsatzgehäuse in jedem Bohrplatz, um die VHSEs während der Färbung in einer untergetauchten Position zu halten. Zwei Tage vor der Bildgebung Polydimethylsiloxan oder PDMS vorbereiten. Stellen Sie ein sauberes Mischgefäß auf eine Waage und tarieren Sie die Waage.
Fügen Sie die Basis hinzu und fügen Sie dann den Vernetzer hinzu. Rühren Sie die Lösung mindestens vier Minuten lang kräftig um und erzeugen Sie kleine Blasen. Nach ausreichendem Mischen das PDMS in eine 90 oder 100 Millimeter große Petrischale gießen.
Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen verschwinden und das PDMS klar ist. Lassen Sie das Vakuum langsam los und entfernen Sie das PDMS. Legen Sie das Gericht in einen Ofen, um über Nacht bei 50 bis 60 Grad Celsius auszuhärten, und stellen Sie sicher, dass das Gericht flach sitzt, damit PDMS gleichmäßig aushärten kann.
Verwenden Sie einen Tag vor der Bildgebung einen Stahlstempel oder ein Handpräzisionsmesser, um einen kreisförmigen Brunnen aus dem PDMS-Blatt zu stanzen oder auszuschneiden, der etwa so groß ist wie das VHSE-Konstrukt. Schneiden Sie einen quadratischen Fleck um den kreisförmigen Brunnen, um einen einzelnen PDMS-Brunnen zu erstellen. Mit einem Glasabdeckungsschlupf von ähnlicher Größe wie der PDMS fügen Sie Cyanacrylatkleber auf die Unterseite des PDMS hinzu und schmieren Sie gleichmäßig mit einer Einwegpipettenspitze.
Zentrieren Sie das Glas und drücken Sie es gut auf das PDMS, während Sie ein klares Glasfenster innerhalb des gestanzten Kreises lassen. Lassen Sie den Kleber vor dem Verwenden über Nacht trocknen. Die Charakterisierung der Epidermis und Dermis zeigt geeignete immunfluoreszierende Marker für die menschliche Haut in den VHSE-Konstrukten.
Cytokeratin 10 ist ein Keratinozytenmarker für die Frühdifferenzierung, der normalerweise alle suprabasalen Schichten in Hautäquivalenten markiert. Involucrin und Filaggrin sind späte Differenzierungsmarker in Keratinozyten und markieren die obersten suprabasalen Schichten in Hautäquivalenten. Das Löschen der VHSE ermöglichte eine einfache Bildgebung in einer Umgebung und eliminierte die Notwendigkeit, das Konstrukt neu auszurichten, um die Dermis und die Epidermis separat abbilden zu können.
Volumetrische Bilder ermöglichen es, 3D-Renderings zu generieren, um Gefäße in jedem Konstrukt abzubilden. Bildstapel wurden in Rechensoftware geladen und ein benutzerdefinierter Algorithmus wurde für das 3D-Rendering und die Quantifizierung verwendet. Die Skelettierung bestimmte das definitive Zentrum jedes Kollagen-IV-markierten Gefäßes und die resultierenden Daten wurden verwendet, um den Gefäßdurchmesser sowie die vaskuläre Fraktion zu berechnen.
Nach diesem Verfahren können Charakterisierungsmethoden wie Barriereanalyse, Rasterelektronenmikroskopie, Lipidprofile und andere durchgeführt werden, um zu verstehen, wie Gefäße spezifisch die epidermale Reifung und Stabilität beeinflussen. Dieses Protokoll ermöglicht geweberelevante und zelltypspezifische Studien in einem vaskularisierten Hautmodell. Es eignet sich besonders für die Forschung in der Alterung und personalisierten Medizin.
