Diese Studie wurde vom NCI (R01-R01-94160 und 155086), IU Simon Cancer Center und Wells Center for Pediatric Research unterstützt.

Diese Studie wurde von der IACUC Ausschuss an der Indiana University School of Medicine genehmigt. 1. Generieren Mäuse mit den richtigen Genotypen <ol><li> Stellen Sie eine Maus-Modell der BCC. Mate-K14-Creer Mäuse (Jackson Labor stock Nummer 005107) mit R26-SmoM2 YFP Mäusen (Jackson Labor stock Nummer 005130) (18) zu erzeugen, K14-Creer + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen. </li><li> Führen Genotypisierung. Tauchen Schwanz Proben (0,5 cm lang) in DirectPCR Schwanz Lyse-Lösung mit 1 mg / ml Proteinase K bei 55 ° C über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Tag entfernen Gewebedebris durch Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (um den Überstand für die Genotypisierung zu halten). Verwenden Sie 1 ul der Überstand für jede PCR-Reaktion mit den Primern und Bedingungen vom Verkäufer empfohlen. Wählen Sie die Mäuse mit den richtigen Genotypen (im Alter von 3-6 Wochen, Buprenorphin bei 0,05-0,1 mg / kg wird über jeden SQ 8-12 h für 2-3 Tage nach Schwanz snip angewendet werden) for Schritt 2. </li></ol> 2. Induce Expression von SmoM2 in Hautkeratinozyten Induce SmoM2 Expression in Keratinozyten durch orale Gabe von Tamoxifen (5 ug / kg Körpergewicht in 50 ml Pflanzenöl in jeder Fütterung) an 5 aufeinander folgenden Tagen per Magensonde mit einer Fütterung Nadel (20 Gauge gekrümmt). 3. Vorbereiten Hautproben Im Allgemeinen sind die Phänotypen schwereren am Ohr und Schwanz in K14creER/R26SmoM2 GFP-Mäusen. Um für die Zell-Analysen vorzubereiten, haben wir zunächst ernten die Maus Haut nach Tieropfer mit einem institutionellen genehmigten Verfahren (CO 2 plus Genickbruch). 4. Isolieren Epidermis <ol><li> Nach der Tötung Mäuse mit einem genehmigten Verfahren (siehe Schritt 3), zu entfernen Fell mit einem Trimmer. Tauchen Hautproben in Dispase-Lösung (5 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) bei 37 ° C für 1-2 h (1 h bei Mäusen weniger als 8 Wochen alt und 2 hfür Mäuse alt als 8 Wochen). </li><li> Nach Dispase Behandlung, separate Epidermis Dermis von Pinzette. </li></ol> 5. Generieren Einzelzellen <ol><li> Um einzelne Zell-Population zu erhalten, Hackfleisch Epidermis durch Schere und dann eintauchen in Collagenase IV-Lösung (1 mg / ml in DMEM mit 10% FBS) für 1-2 Stunden bei 37 ° C in einer 50 ml Tube. Versuchen Sie, schwenken Sie die Rohre alle 20 min zu Zelle Dissoziation helfen. </li><li> Untersuchen Zelle Dissoziation unter dem Mikroskop. Wenn einzelne Zellen in der Kollagenase Medium detektiert werden kann, Inkubieren der Probe für weitere 30 min, um die Zellausbeute zu erhöhen. Im Allgemeinen kann die Epidermis von einer Maus Ausbeute bis zu 10 7-Zellen. </li><li> Filtern Sie die Mischung durch Gewebe Zellsieb (Porengröße 70 um), Spin-Zellen nach unten bei 1500 rpm über Tischgerät Zentrifugation und waschen einmal Zeit mit PBS. </li></ol> 6. Label-Cells und Führen Durchflusszytometrie Analysen <ol><li> Die Zellen in 10% FBSin PBS mit 2,5 × 10 6 Zellen / ml, um die unspezifische Bindung zu blockieren (auf Eis für 30 min) </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot der Zellen zu je 1,5 ml Reaktionsgefäße für bestimmte Antikörpermarkierung. In verschiedenen Antikörpern in jedes Röhrchen in einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Mix Antikörper mit Zellen über eine sanfte Vertex für einige Sekunden und lassen Sie sie auf Eis für 30 min, dann waschen mit 1 ml PBS. Für BCC Proben verwendeten wir die Antikörper für folgenden Biomarker: CD11b-PE sowie GR1-APC (myeloischen Zellen oder myeloiden abgeleitete Suppressor-Zellen); Vimentin-FITC (Fibroblasten) (siehe Reagenzien für Details). </li><li> Zur intrazellulären Färbung, verwenden wir ein Kit und folgen Sie der Hersteller-Handbuches (siehe Reagenzien für Details). Wir verwenden frische Zellen Zelloberflächenmarker analysieren. Nach Oberfläche Marker Färbung, waschen Sie die Zellen, und resuspendieren sie in PBS. In DAPI dem Zellgemisch in einer Endkonzentration von 1 ug / ml. DAPI färbt tote Zellen, die ausgeblendet sein wird von der weiteren Analysen. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit speziellc Software. Wir wählen Sie zunächst einzelne Zellen auf der Basis der FSC gegen SSC Plot, und verwenden DAPI negativen Population (live-Zellen) zur weiteren Analyse. </li></ol>

<ol>
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Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. 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Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model:+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression.">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).</li><li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes.">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben ein Verfahren zur Analyse Zellpopulation in BCCs beschrieben. Tumorgewebe sind konsistent vieler Zelltypen und jeder Zelltyp verhält sich anders zu einem bestimmten Zeitpunkt der Krebsentstehung, das ist sehr schwer, selbst zurückzuerobern unter den besten Bedingungen in vitro. Über dieses Protokoll haben wir gezeigt, dass die Entwicklung von Basalzellkarzinom durch Expansion der epidermalen Stammzellen sowie Rekrutierung von myeloischen Zellen begleitet wird. Im Vergleich mit Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Analysen geben Zellpopulation Analysen eine quantitative Beurteilung der Zellpopulation Änderungen seit spezifischen Antikörpern zu einer Vielzahl von Zelltypen sind jetzt verfügbar. Aus diesem Protokoll werden 10 Wochen benötigt, um die Studie abzuschließen, weil phänotypische Veränderung von Geninduktion erfordert Zeit. Es ist daher wichtig, um das Experiment im Voraus planen. Für Zellisolation und Analysen können zwei ganze Tage benötigt werden. Da lebende Zellen sind für analys verwendetes, ist es wichtig, eine FACSCalibur vor der Zeit zu reservieren. Wir haben auch bekannte Probleme bei der Arbeit mit diesem Protokoll (siehe unten). Nach unserer Erfahrung sind unten gemeinsamen Probleme, die wir angetroffen: <ol><li> Schlechte Trennung der Epidermis: Dies kann durch unvollständige Dispase Behandlung (Bitte erhöhen Sie die Zeit von diapase Behandlung) oder unzureichende Dispase Lösung (Die Haut braucht, um völlig in Dispase getaucht werden) verursacht werden. Wir benutzen mindestens 5 ml Dispase Lösung für eine Maus. Das Volumen kann auf der Basis der Größe der Haut variieren. </li><li> Geringe Ausbeute von Zellzahl: Dies kann aufgrund unvollständiger Verdauung mit Kollagenase IV. Prüfen Sie bitte zuerst Kollagenasekonzentration oder Ablaufdatum. Dies kann auch durch unzureichende Menge Epidermis zurückzuführen sein. Darüber hinaus sollte Enzymverdau bei 37 ° C unter Schütteln (justieren Sie bitte Temperatur vor durchführen Verdauung) durchgeführt. </li><li> Zellklumpen: Dies ist sehr häufig für die Hautzellen (Pipette Zellenein paar Mal, nachdem sie durch Sieb (vor Zentrifugation), oder die Existenz von Mg 2 + und Ca 2 + in der Lösung (bitte verwenden Mg 2 + und Ca 2 +-freiem PBS für Zelle wash). </li><li> Zu viele tote Zellen: Dies kann eine Folge der verschlechterten Gewebe sein (bitte verwenden frische Gewebe) oder über-Verdauung (vermeiden Sie längere Inkubation mit Dispase und Collagenase IV). </li></ol> Dieses Protokoll kann mit Knochenmarktransplantation oder Gewebetransplantation, um die Zelle Herkunft zu prüfen kombiniert werden. Beispielsweise nach Transplantation von GFP-exprimierenden Knochenmarkzellen zu letal bestrahlten Mäusen ermöglicht es uns, den Beitrag von Knochenmarkzellen an Tumor-assoziierte Fibroblasten und myeloiden Zellen zu untersuchen. Ebenso können Hauttumoren in eine neue Mäusewirt an Tumor-Wirt-Interaktionen untersuchen transplantiert werden. Neben Zellpopulation Veränderungen während der Krebsentstehung zu untersuchen, wird dieses Protokoll auch den Forschern ermöglichen, zu prüfen,Effekte der medikamentösen Therapie der Zellen im Tumor Umgebung. Obwohl dieses Protokoll wurde entwickelt, um für Zellpopulation Analysen während Haut verwenden Krebsentstehung, leichten Modifikationen auch für andere Krebsarten gemacht werden. Zusammenfassend kann Zellpopulation Analysen in Mausmodellen von Hautkrebs geben uns die dynamischen zellulären Veränderungen während der Krebsentstehung, was zu einem besseren Verständnis der Zellbiologie in neoplastischen Transformation und verschiedenen zellulären Ereignissen im Transformationsprozess.

Als häufigste Form von Krebs beim Menschen wirkt Basalzellkarzinom (BCC) über 2 Millionen Amerikaner pro Jahr 1. Es gibt zunehmend Hinweise zeigen, dass abnorme Aktivierung von Hedgehog (Hh)-Signalisierung ist die treibende Kraft zugrunde BCC Entwicklung (Bewertet in 2,3). Veränderungen der Hh-Signalgebung in BCCs gehören inaktivierende Mutationen des PTCH1 4-6, gain-of-function Mutationen SMO 7-9 und aberrante Expression von Hh Weg Transkriptionsfaktoren GLI1 10 und 11 GLI2 oder seltene Mutationen inaktiviert negativer Regulator von Su (Fu ) 12. Durch all diese und andere Studien, hat Federal Drug Administration (FDA) hat vor kurzem die Verwendung von Hh-Signal-Inhibitor zur Behandlung von metastasierendem Vismodegib und lokal fortgeschrittenem BCCs 13-15 zugelassen. Trotz all dieser Erfolge 16, haben wir noch nicht verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die das Hh-Signal treibt carcinogenesis. Etablierung von Tiermodellen mit Gewebe-spezifische Aktivierung des Hh-Signal ist immer noch für diese Studien und für unser Verständnis von Resistenzen wichtig. Bei Mäusen weiß Wildtyp-Mäusen nicht entwickeln BCCs, auch unter hoher Dosen von Karzinogene, UV oder ionisierende Strahlung. Im Gegensatz dazu Ptch1 + / - Mäuse sind anfällig für BCC Entwicklung 17,18. Die Penetranz der BCC Entwicklung in Ptch1 + / - Mäusen über 50%, obwohl Ptch1 18,19 + / - Mäuse selten entwickeln ausgewachsenen BCCs wenn unter normalen Bedingungen gehalten. Aufgrund der embryonalen Letalität Ptch1 - / - wird gewebespezifischen Knockout von PTCH1 allgemein zur Untersuchung 20 verwendet. Darüber hinaus bedingten Haut-spezifische Expression der onkogenen SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP oder KRT14-cre) führt zur Bildung von mehreren mikroskopischen BCCs in einem sehr frühen Alter, das einen einfachen genetischen Test für Hh-Signal zu tunwnstream von SMO 21. Es gibt drei wichtige Fragen in unserem Wissen über BCC Biologie. Erstens ist die zelluläre Herkunft des BCCs nicht ganz klar. Während einige Studien unterstützen die von Haarfollikel rühren als Stammzell-Website 22-24, Youssef et al. Den 25 lokalisiert Mäusezelllinie der Herkunft der kutanen Hh-driven Tumoren in der inter-follikulären Epidermis Region sein, nicht in den Haarfollikel , mit zellspezifischen Cre die Expression eines ROSA26 angetriebenen transgene mutante SMO zu aktivieren. Zweitens zellulären Interaktionen während BCC Entwicklung sind nicht gut verstanden. Es ist bekannt, dass Keratinozyten mit aktiviertem Hh-Signal kann zur Bildung von BCCs führen, aber auch andere zelluläre Veränderungen sind nicht gut verstanden. Darüber hinaus kann die Behandlung von Smo-Antagonisten bei Mäusen zu Resistenzen führen 26-28. So neue Targets für BCC werden dringend benötigt. Das Verständnis dieser drei Fragen erfordert Analysen der zellulären Veränderungen in Mäusen während carcinogenesis. Während mehrere Methoden zur Keratinocytenkultur, Durchflusszytometrie und Haut Stammzellisolation 29-31 veröffentlicht wurden, gibt es noch keine umfassenden Verfahren für Zellanalysen in Maus BCCs. Durch die Kombination von Methoden für die Maus-Modell der BCCs, Trennung der Epidermis, die Erzeugung von einzelnen Zellen aus Geweben und Zellen analysiert, werden wir Leser mit einer Reihe von Verfahren bereitzustellen, um Zellkommunikation, zellulären und molekularen Interaktionen während BCC Entwicklung zu studieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll wird dem Leser, um zu sehen, wie die einzelnen Verfahren erreicht wird. Darüber hinaus stellten wir einige Daten zu veranschaulichen, was die Ergebnisse aussehen sollte und Fehlerbehebung, um den Lesern zu Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Verfahren zu überwinden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

Krebs ist eine Entwicklung mehrstufigen Prozess mit vielen Zelltypen, einschließlich Krebs-Vorläuferzellen, Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen. Jede Art von Zellen erfährt Signalisierung und funktionelle Veränderungen bei der Krebsentstehung. Die aktuelle Herausforderung für viele Krebs-Forscher ist es, diese Änderungen in jeden Zelltyp während des mehrstufigen Prozess in vivo zu sezieren. In den letzten Jahren haben die Autoren eine Reihe von Verfahren, um unterschiedliche Zellpopulationen während Hautkrebs Entwicklung mit K14creER/R26-SmoM2 YFP Mäusen isolieren entwickelt. Das Verfahren wird in 6 Teile aufgeteilt: 1) Erzeugen geeigneter Mäusen der Studie (K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Mäusen in diesem Protokoll), 2) Induzieren SmoM2 YFP-Expression in der Haut von Mäusen, 3) Herstellung von Maus Hautbiopsie, 4) Isolieren Epidermis der Haut; 5) Herstellen einzelner Zellen aus Epidermis, 6) Kennzeichnung einzelne Zellpopulationen für die Durchflusszytometrie-Analyse.Erzeugung ausreichender Anzahl der Mäuse mit der rechten Genotyp ist der limitierende Schritt in diesem Protokoll, das kann bis zu zwei Monaten. Der Rest der Schritte zu unternehmen, ein paar Stunden bis zu einigen Tagen. In diesem Protokoll haben wir auch einen Abschnitt zur Fehlerbehebung. Obwohl wir uns auf Hautkrebs, kann dieses Protokoll modifiziert, um für andere Tiermodelle menschlicher Krankheiten anzuwenden.

Es ist bekannt, dass Mäuse nicht entwickeln Basalzellkarzinomen außer mit Hh Signal-Aktivierung. Abbildung 1 zeigt die Haut nach Phänotyp induziert die Expression der onkogenen geglättet, SmoM2 YFP. Abbildung 2 Analyse von myeloischen Zellen in normalen und Tumor-tragenden Mäusen zeigt. CD11b + Gr1 + Zellen aus Knochenmarkszellen stammen, und einige von ihnen abgeleitet Suppressorzellen myeloischen. In der normalen Situation, die CD11b + + Gr1 Zellpopulation kaum nachweisbar, wird aber in Reaktion auf eine Entzündung oder Tumor-Entwicklung zu erhöhen. Wir zeigten, dass die induzierte Expression von SmoM2YFP in Haut führt zu einer Erhöhung der CD11b + Gr1 + Zellen. Derzeit sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen diese Änderung in BCCs nicht klar. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Abbildung 1. Morphological Änderungen nach SmoM2YFP Induktion in der Haut von Mäusen. Die obere zeigt ein Diagramm der Maus Genotypen. Das mittlere Feld: die K14creER + und R26-SmoM2 YFP + Maus mit Tamoxifen behandelt wurden, zeigten grob Anomalie in der Haut (rechts) sowie Haut-Tumoren in der H &amp; E Bereich (links). Die untere Platte: die Maus ohne SmoM2YFP Induktion zeigten normale aussehende Haut (rechts) und keine abnorme Morphologie in der H &amp; E Bereich (links). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flow-Analyse der CD11b + Gr1 + Zellen. Um die Änderung von CD11b + Gr1 + Zellen während der Entwicklung von Hautkrebs untersuchen, isolierten wir Einzelzellen und gefärbt mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD11b und Gr1. Nach der Analyse mit FlowJo, bemerkten wir einen Anstieg dieser Zellpopulation in Hautgewebe von Tamoxifen-behandelten Mäusen.

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Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.

Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Aufrufe.  Indiana University. Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.

Serie: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Genaue und einfache Messung der pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β mit einem Vollblut Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Forschung

Medizin

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Nierenkapsel Xenografting und subkutane Implantation Pellet für die Beurteilung von Prostata-Karzinogenese und benigne Prostatahyperplasie

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Trockenblut Sammlung von Gesundheits-Biomarker zur Teilnahme am Bevölkerungsstudien maximieren

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murine Endoskopie für<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Eine Maus fetalen Hautmodell von Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Eine Methode der trigonometrischen Modellierung der saisonalen Schwankungen mit Multipler Sklerose Relapse Daten zeigten,

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to understand health effects of child growth and adiposity. Gold standard methods of measuring adiposity, such as dual X-ray absorptiometry (DXA), may not be feasible in large field studies. Research staff can, however, complete anthropometric measurements, such as body circumferences and skinfold measurements, using inexpensive portable equipment. In this protocol we detail how to obtain manual anthropometric measurements from children, including standing and sitting height, weight, waist circumference, hip circumference, mid-upper arm circumference, triceps skinfold thickness, and subscapular skinfold thickness, and procedures to assess the quality of these measurements. To demonstrate accuracy of these measurements, among 1,110 school-aged children in the pre-birth cohort Project Viva we calculated Spearman correlation coefficients comparing manual anthropometric measurements with a gold standard measure of body fat, DXA fat mass1. To address reliability, we evaluate intra-rater technical error of measurement at a quality control session conducted on adult female volunteers.

In epidemiologic studies of children, well-trained research staff can accurately and precisely assess weight, height, sitting height, skinfold thicknesses, and body circumferences.

Bewertung der Kinder Anthropometrie in einem Großraum Epidemiologische Studie

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to ...