Arbeit unterstützt von den National Institutes of Health Grants R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forschung Core und HEI. Sein Inhalt ist ausschließlich die Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH oder HEI. Die Autoren erklären, keine bestehenden oder potenziellen Interessenkonflikt.

1. Isolierung von OHCs <ol><li> Begin dieses Verfahren durch die Ernte Felsenbeine von Meerschweinchen, Mäuse oder Ihre Säugetierabfällen Modell. </li><li> Dann öffnen Sie den zeitlichen Knochen mit einem Hammer Zange, um die Cochlea aussetzen, und tauche sie in Leibovitz L-15. Entfernen Sie überschüssige Knochen vorsichtig, halten die knöchernen Schale intakt. Diese ist ein allgemeines Verfahren für Felsenbeine von Säugetieren können kleinere Änderungen an der Technik notwendig sein, wenn es um zeitliche Knochen von sehr kleinen Tieren. In alten Tieren der Bulla ist in der Regel verkalkt, die Einführung einer zusätzlichen Komplikation des Verfahrens. </li><li> Unter mikroskopischer Beobachtung, öffnen Sie den apikalen Bereich der Cochlea und beseitigen Stria vascularis und Ligamentum spirale mit der Spitze eines Nr. 11 Skalpell, wählen Sie eine Micro-Punkt und einer Geldstrafe Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das Corti-Organ aus dem Cochlea-Modiolus mit der Pinzette, und steckte es in 1mg/ml Kollagenase in L-15 bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wenn OHCs von basalen Windungen der Cochlea benötigt werden, entfernen Sie die knöcherne Hülle um die Basis der Schnecke mit der Abholung, und trennen Sie die Spirale aus dem Schläfenbein mit dem Skalpell, bevor Sie das Corti-Organ. </li><li> Übertragen Sie die Corti-Organ, um die Aufnahme Kammer mit einem 50 ul Hamilton-Spritze. Danach distanzieren Zellen durch Rückfluss durch die Nadel. </li></ol> 2. Versuchsaufbau <ol><li> Schematische Darstellung des externen elektrischen Wechselfeld (EAEF) Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System (Abb. 1). Die Steuerschaltung wurde speziell auf die Engineering-Core des House Ear Institute umgesetzt. </li><li> Der Versuchsaufbau ist in unseren Experimenten verwendet besteht aus einem Axiovert 135TV inversen Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) mit einer alternativen LED-basierte Beleuchtung (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), zwei elektronische Mikromanipulatoren (Eppendorf &quot;PatchMan&quot;, Deutschland), eine PC-gesteuerte ultra-High-Speed-Photron FastCAM X 1024 PCI-Kamera (Photron USA Inc.) in den Keller-Anschluss und einen zusätzlichen regulären CCD-Kamera in der trinokularen Port. Die FastCAM Kamera kann Bilder bei hohen Frequenzen (bis zu 100.000 fps) und hoher Auflösung (zB 1024 x 1024 Pixel bei 1.000 fps, 512 x 128 bei 10.000 fps, 384 x 96 bei 18.000 fps, und so weiter) zu erfassen. Die Bilder von der High-Speed-Kamera zur Verfügung gestellt werden direkt in den PC-Monitor beobachtet, während die CCD-Kamera auf einen anderen Monitor angeschlossen ist. Die LED-Beleuchtung-System arbeitet in zwei verschiedenen Modi: Low-Power-Analog-und High-Power-digital. Alle vorläufigen Verfahren (Elektroden positioniert, Zell-Positionierung, Fokus, usw.) werden unter Verwendung der Low-Power-Analog-Modus. Die High-Power-Beleuchtung wird durch die Öffnung der Verschluss der Kamera eingeschaltet und dann ausgeschaltet, indem Verschlussgeräusch, die Erleichterung Wärmeableitung. Homemade-Software, auch bei der House Ear Institute Maschinenbau-Core entwickelt, die auf dem gleichen PC steuert die Auslöser der High-Speed-Kamera, die LED-basierte Beleuchtung, und die EAEF. Eine herkömmliche Digitalkamera in der Front-Port können Standbilder, wie gebraucht. (Abb. 2 A). </li><li> Elektroden (zwei 0,25 mm-Durchmesser Ag Drähte mit Spitze Abstand von 0,8 mm) angetrieben werden, um Position mit einer der elektronische Mikromanipulatoren. Elektroden-Position wird visuell und durch das mikroskopische Bild beobachtet; eine Änderung in der Brennebene des Bildes zeigt an, dass die Elektroden der Unterseite des experimentellen Kammer berührt. Zunächst wird das elektrische Feld kalibriert mit einem externen Elektrode. Diese Elektrode misst das elektrische Potential an verschiedenen Punkten, wodurch eine &quot;Landkarte&quot; des elektrischen Feldes. Wenn ein einzelner isolierter äußeren Haarzellen ist zwischen den Spitzen der Elektroden mit seiner Längsachse parallel zum angelegten EAEF platziert, wird sie bewegen verlängert und verkürzt auf der gleichen Frequenz des elektrischen Feldes. Wenn die Zelle senkrecht zum Feld platziert eine andere Art von OHC Antwort (Biegen) können beobachtet und untersucht werden. (Abb. 2 B) </li></ol> 3. EAEF Stimulation und Bilderfassung <ol><li> Vier verschiedene Stimulationsprotokolle sind wählbar (Abb. 3): <ol><li> kontinuierliche einzigen Frequenz (Abb. 3 A). Beachten Sie, dass Stimulus-Modus, Frequenz, Amplitude und Wellen-Typ ausgewählt werden mit dem hausgemachten Steuerungs-Software (rote Kreise) werden. </li><li> bursted einzigen Frequenz (Abb. 3 B). Die Länge des Bursts und Lücken zwischen Burst sind auch wählbar. </li><li> linear sweep (Abb. 3 C). Die Anfangs-und End-Frequenzen sind wählbar. </li><li> Multi-Stimulation (Abb. 3 D). Einzel-Frequenz und linear fegt können in einem einzigen Experiment kombiniert werden. Nach Auswahl der entsprechenden Parameter konfiguriert der Steuerungs-Software des Systems und ermöglicht dem Bediener, Licht-synchronisierte Videoaufzeichnung und-Zell-Stimulation durch Klicken auf einen einzigen Tastendruck in initiierendem Computer-Bildschirm. </li></ol></li><li> Die Bilder werden im AVI-Format zur weiteren Analyse bei hohen Frequenzen erfasst. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> In diesem Film zeigen zwei isolierten äußeren Haarzellen Veränderungen in der Länge oder Krümmung, wenn sie als mit einer externen elektrischen Wechselfeld, das parallel oder quer ist, bzw. stimuliert, um ihre Längsachse. (Movie # 2). </li><li> OHCs bewegliche Antworten sind off-line mit ProAnalyst Software (Xcitex Inc., Cambridge, MA) analysiert. &quot;Feature Tracking&quot;-Funktion in dieser Software bietet die Entfernung zwischen zwei Punkten Frame-by-Frame (Abb. 4). Bei der Zellteilung verkürzen die Distanz zwischen den Punkten an der Spitze (Kutikularplatte; rote Farbe) ausgewählt und die Basis der Zelle (Basal-polig; grüne Farbe) kleiner ist, und nimmt mit der Zellstreckung. Der Film zeigt die Software die Analyse Frame-by-Frame die Änderungen in der Länge. Die Leiste am unteren Rand des Bildes zeigt die Spur der Bewegung. In diesem Beispiel ist die totale Veränderung in der Länge etwa 6,5 ​​Pixel. </li><li> &quot;Contour Tracking&quot;-Funktion in ProAnalyst Software kann erkennen, Zellkante und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt (Abb. 5). </li><li> Polystyrol-Mikrokugeln hinzugefügt, um die Badlösung zufällig und fest an der Plasmamembran (Abb. 6 A) befestigen. Verschiedene Mikrosphären können gleichzeitig ausgewählt werden, und die Software kann automatisch verfolgen sie alle Frame für Frame. Auf diese Weise können die Zellen in Abschnitte unterteilt werden und die Beweglichkeit der einzelnen Abschnitte ausgewertet unabhängig. (Abb. 6 A) </li><li> Durch die Auswahl Mikrosphären an den seitlichen Rändern der Zelle Bild befindet, Veränderungen in der Länge der einzelnen Segmente und Änderungen in Winkel von einem Segment in Bezug auf andere (Biegen) können auch unabhängig voneinander beurteilt werden. (Abb. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung der EAEF Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. A) Bild des Versuchsaufbaus. B) Detail des Mikroskoptisches, mit Karikaturen der Elektroden und einem OHC platziert zwischen ihnen mit seiner Längsachse parallel zum elektrischen Feld. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. A) Benutzeroberfläche des hausgemachten Steuerungs-Software für Single-Frequency-Stimulation konfiguriert. Die ausgewählten Parameter werden in rot eingekreist. B) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Burst Single-Frequency Stimulation konfiguriert. C) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Linear Sweep Stimulation konfiguriert. D) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Multi-Stimulation konfiguriert. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Einzelbild eines OHC mit zwei Punkten an der Basis (grün) und die Spitze (rot) der Zelle bzw. mit dem &quot;Feature-Tracking&quot;-Funktion des ProAnalyst Software selektiert. Die Kurve unterhalb der Zelle zeigt die periodischen Änderungen des Abstands zwischen den ausgewählten Punkten mit elektrischen Stimulation verbunden ist. Verschieben Sie die vertikale Leiste verschiedenen Rahmen können für einzelne Analyse ausgewählt werden. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Der &quot;Contour Tracking&quot;-Funktion in ProAnalyst erkennt die Zelle Rand und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. A) Das aufgenommene Bild eines isolierten OHC mit Polystyrol-Mikrosphären (oben), und das gleiche Bild mit fünf Mikrosphären individuell ausgewählt (unten) verziert. Eine andere Farbe wurde auf jedes Mikrokügelchen zugewiesen, und ihre Verschiebungen lassen sich individuell und automatisch verfolgt werden Frame für Frame, analysiert und verglichen. B) Segmente von beliebiger Länge kann durch die Auswahl Polystyrol-Mikrosphären an den Rändern der Zelle befindet definiert werden, und Änderungen in der Länge dieser Segmente sowie Änderungen in der Ausrichtung von einem Segment in Bezug auf andere (Zelle Biegen) können automatisch ausgewertet werden Frame für Rahmen mit der Bildanalyse-Software. Movie 1. Isolation von Meerschweinchen OHCs. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 2. OHCs parallel und senkrecht zur EAEF zeigt typische Elektromotilität und Biegen Antworten. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a>

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	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

Die experimentelle Methode hier vorgestellten ermöglicht die Schätzung OHC motile Reaktionen in den kHz-Bereich ohne Einschränkung auf die Zelle der Bewegung. Verschiedene Stimulationsprotokolle, zusätzliche Markierungen (Mikrosphären), sowie Veränderungen in der Ausrichtung der Zelle in Bezug auf das elektrische Feld, machen es möglich, neue Aspekte der OHC Motilität mit einer Detailgenauigkeit bisher unzugänglichen untersuchen. Andere Methoden, z. B. die Verwendung von Fotodioden 9 oder Laser-Doppl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (Typ 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/ml in L-15 </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

OHCs sind zylindrisch sensomotorischen Zellen im Corti-Organ, das Hörorgan im Inneren des Säuger-Innenohrs befindet. Der Name &quot;Haarzellen&quot; leitet sich von ihrer charakteristischen apikalen Bündel von Stereozilien, ein entscheidendes Element für die Detektion und Transduktion von Schallenergie 1. OHCs der Lage sind, verändern ihre Form-länglich, zu verkürzen und biegen in Reaktion auf elektrische, mechanische und chemische Stimulation, als eine motorische Reaktion entscheidend für Cochlea Verstärkung der akustischen Signale 2. OHC Stimulation induziert zwei verschiedene bewegliche Antworten: i) Elektromotilität, auch bekannt als schnelle Motilität, Veränderungen in der Länge im Bereich von Mikrosekunden von elektrisch angetriebenen Konformationsänderungen in Motorproteine ​​dicht in OHC Plasmamembran verpackt abgeleitet, und ii) langsam Beweglichkeit, Form Veränderungen in der Millisekunde bis Sekundenbereich mit Zytoskelett-Reorganisation 2, 3. OHC Biegen ist mit Elektromotilität verbunden sind, und das Ergebnis entweder von einer asymmetrischen Verteilung der Motorproteine ​​in den seitlichen Plasmamembran, oder asymmetrische elektrische Stimulation dieser Motorproteine ​​(zB mit einem elektrischen Feld senkrecht zur Längsachse der Zellen) 4. Mechanische und chemische Reize auslösen Wesentlichen langsam bewegliche Antworten, auch wenn Veränderungen in der ionischen Bedingungen der Zellen und / oder deren Umgebung kann auch Impulse für die Plasmamembran-embedded Motorproteine ​​5, 6. Da OHC bewegliche Antworten ein wesentlicher Bestandteil des cochleären Verstärkers, die qualitative und quantitative Analyse dieser beweglichen Reaktionen auf akustische Frequenzen (etwa von 20 Hz bis 20 kHz beim Menschen) sind, ist ein sehr wichtiges Thema im Bereich des Hörens Forschung 7. Die Entwicklung neuer Imaging-Technologie kombiniert Hochgeschwindigkeits-Videokameras, LED-basierten Beleuchtungssystemen und ausgefeilte Bildanalyse-Software bietet nun die Möglichkeit, zuverlässige qualitative und quantitative Untersuchungen der beweglichen Reaktion von isolierten OHCs an ein externes elektrisches Wechselfeld (EAEF) durchführen 8. Dies ist eine einfache und nicht-invasive Technik, die die meisten der Grenzen der bisherigen Ansätze 9-11 umgeht. Darüber hinaus bietet die LED-basierte Beleuchtung System extreme Helligkeit mit unbedeutenden thermischen Auswirkungen auf die Proben und wegen der Verwendung von Video-Mikroskopie, ist die optische Auflösung mindestens 10-fach höher als bei konventionellen Lichtmikroskopie Techniken 12. Zum Beispiel mit dem Versuchsaufbau hier beschrieben, können Veränderungen in der Zelle Länge von etwa 20 nm routinemäßig und zuverlässig bei Frequenzen von 10 kHz erfasst, und diese Auflösung kann bei niedrigeren Frequenzen verbessert werden. Wir sind zuversichtlich, dass dieser experimentelle Ansatz wird dazu beitragen, unser Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die OHC Beweglichkeit zu erweitern.

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Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Aufrufe.  House Ear Institute. Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.

Serie: Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

Eine Mensch-Maschine-Schnittstelle Integration von Low-Cost-Sensoren mit einem Neuromuskuläre Elektrostimulation System zur Post-Stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Beurteilung der neuromuskulären Funktion Mit Perkutane elektrische Nervenstimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effekte der transkraniellen Wechselstrom Stimulation auf Primärbewegungsrinde durch Online-kombinierter Ansatz mit Transcranial magnetische Anregung

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Transkranielle elektrische Hirnstimulation in Alert Nagetiere

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...