Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Aufnahme von regulären Dextran fluoreszierend mit Texas Red in lebenden Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die drei Kilodalton Texas Red Dextran verwendet werden können, um die Mechanotransduktionskanalfunktion in lebenden Haarzellen zu bewerten. Um die Cochlea zu ernten, legen Sie den Schädel einer postnatalen Sechsermaus in eine 60-Millimeter-Kulturschale mit Leibovitz' L-15-Medium und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen Ende bis zum hinteren Ende des Schädels und über die äußeren Gehörskanäle zu machen.
Falten Sie die Haut in Richtung der Nase, um den Schädel freizulegen und einen Schnitt von hinten nach vorne des Schädels und über die Augenlinie zu machen. Trennen Sie den Schädel in zwei Hälften und verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um das Gehirn zu entfernen. Wenn die zeitlichen Knochen beobachtet werden können, verwenden Sie eine kleine Schere, um diese Knochen zu schneiden, um das Gewebe zu verbrauchen.
Untertauchen Sie die zeitlichen Knochen in die 35-Millimeter-Schale mit frischem L-15-Medium und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop, das mit einem Weitfeld-Okular und einer externen Wechselstrom-Halogenlichtquelle ausgestattet ist. Verwenden Sie Zangen, um das umgebende Cochlea-Gewebe, halbkreisförmige Kanäle und vestibuläre Organe zu entfernen. Sobald die Cochlea seziert und in eine neue Schüssel mit frischen L-15-Medien gelegt wurde, verwenden Sie chirurgische Zangen, um eine Stichwunde am runden Fenster und eine Punktion im apikalen Cochlea-Bereich zu machen.
Wenn alle Cochleae geerntet sind, legen Sie das Gewebe in einen Brunnen einer neun Well-Glas-Depressionsplatte mit 200 Mikroliter frisches L-15 Medium. Für die Dextran-Kennzeichnung der isolierten Gewebe, ersetzen Sie das Medium aus jeder Probe gut mit 200 Mikroliter frisches L-15-Medium, ergänzt durch zwei Milligramm pro Milliliter der fluoreszenz konjugierten Dextran von Interesse. Inkubieren Sie die Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur und 25 Umdrehungen pro Minute in einem dreidimensionalen Shaker in einem geneigten Winkel von 25 Grad, der vor Licht geschützt ist.
Am Ende der Inkubation die Gewebe einmal mit Medium und einmal mit HBSS für zwei Minuten pro Wäsche waschen. Nach der zweiten Wäsche die Proben in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, gefolgt von zwei schnellen und sanften Wäbungen in HBSS. Nach der zweiten Wäsche verwenden Sie feine Spitzenzange, um den Cochlea-Knochen, das Spiralband und die tektoriale Membran zu entfernen und das isolierte Organ von Corti in HBSS zu waschen.
Achten Sie beim Entfernen der transparenten tektorialen Membran besonders darauf, da das Gewebe an den Haarzellen während dieses Schritts leicht beschädigt werden kann. Um das F-Actin zu kennzeichnen, permeabilisieren Sie die Proben in 0,5%Triton X-100 in PBS, ergänzt durch 100 bis 200 Verdünnung von fluoreszierend markiertem Phalloidin für 30 Minuten bei Lichtschutz im Raum. Am Ende der Inkubation das Gewebe zwei- bis dreimal in frischem HBSS pro Waschgang waschen, wie gezeigt, gefolgt von einer einzigen Wäsche in PBS.
Verwenden Sie ein geeignetes Montagemedium, um das Organ von Corti-Geweben auf Glasmikroskop zu montieren, das Haarstereocilia Seiten nach oben schiebt und die Proben auf einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop mit dem 63X Öl-Immersion-Objektiv abbilden. Nach einer zweistündigen Inkubation mit drei Kilodalton-Dextran fluoreszierend konjugiert mit Texas Red, Organ von Corti Explant aus wilden Typ postnatalen Tag sechs Mäuse zeigen eine robuste und spezifische Kennzeichnung von inneren und äußeren Haarzellen. Die Bildgebung der Haarzellstereocilia und der Zellkörper zeigt, dass nur die Zellen, die drei Kilodalton Dextran Texas Red in ihren Zellkörper integriert haben, auch eine fluoreszierende Etikettierung ihrer Stereocilia demonstrierten.
Wichtig ist, dass entlang der Stereocilia ein gleichmäßiges fluoreszierendes Signal mit Anreicherung an den Spitzen der kürzeren Stereocilia-Reihen beobachtet wird, in denen sich der Mechanotransduktionskanal befindet. Vesikelartige Strukturen im Zellkörper der Haarzellen und der benachbarten Stützzellen werden ebenfalls beobachtet, was darauf hindeutet, dass Dextran Texas Red auch durch Endozytose aufgenommen werden kann. Größere 10 Kilodalton Dextrans produziert auch ein vesikelartiges Muster im Zellkörper von Haarzellen und unterstützenden Zellen.
Insbesondere verhindert das Vorhandensein eines Kalziumchelators oder mechanotransduktionskanalblockers die Stereocilia-Etikettierung und die Aufnahme von drei Kilodalton-Dextran Texas Red in Haarzellen. Das vesikelartige Muster wird jedoch immer noch in Gegenwart einer Mechanotransduktionskanalblockade beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Aufnahmemuster unabhängig von funktionellen MET-Kanälen ist. Es ist sehr wichtig, das Organ des Corti-Gewebes sorgfältig zu sezieren und die richtige Ausrichtung der Haarzellen zu bestätigen, bevor das Gewebe für die Bildgebung montiert wird.
Nach der Dextran-Kennzeichnung von lebenden und funktionellen Haarzellen kann eine Immunfärbung des festen Gewebes durchgeführt werden, um bestimmte Zelltypen von Proteinen von Interesse zu identifizieren.
