Diese Praktische kann uns helfen, dynamische Veränderungen der Nanostrukturkomponenten der mechanischen elektrischen Transduktionsmaschinerie an der Oberfläche der Haarzellsterixzilienbündel zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Zeitraffer-Bildgebung der Oberfläche lebender Zellen mit komplexer Topographie bei einzelnen Nanometern Auflösung und ohne physischen Kontakt mit der Probe. Diese Technik kann auf fast jede lebende Zelle angewendet werden.
Wir haben zuvor die Oberfläche von Lungenepithelzelllinien, die mit Viren, Muskelzellen, infiziert sind, in My Image Bacteria Soon abgeglichen. Testen Sie die Nanopipetten zu Beginn jeder Bildgebungssitzung. Nachdem Sie eine Nanopipette hergestellt haben, suchen Sie nach Blasen, entfernen Sie eventuell vorhandene Blasen und montieren Sie die Nanopipette auf dem Pipettenhalter des Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskops.
Bei vier Millilitern Badlösung in die Kammer und legen Sie die Kammer auf die HPICM-Stufe. Führen Sie die Masseelektrode in die Badlösung ein und stellen Sie sicher, dass die Spannung, die über den Patch-Clamp-Verstärker an die Pipette angelegt wird, Null ist. Nachdem Sie den Mikromanipulator in die vertikale Position gebracht haben, bewegen Sie die Pipette in Z, bis sie die Flüssigkeit berührt, und stellen Sie den Verstärkerversatz auf Null, bevor Sie plus 100 Millivolt hinzufügen, um den Pipettenstrom zu überprüfen.
Verwenden Sie Silikonkleber, um den AFM-Kalibrierstandard an der Kammer zu befestigen und die Probe mit vier Millilitern HBSS zu bedecken. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Kammer an der X Y-Stufe des HPICM-Setups zu befestigen, und laden Sie wie gezeigt eine neue Nanopipette auf den Halter. Nachdem Sie den Widerstand und den Durchmesser der Nanopipette getestet haben, stellen Sie den Strom auf ein Nanoampere ein.
Verwenden Sie einen groben Patch-Clamp-Manipulator, um die Nanopipette ungefähr über der Mitte des Kalibrierstandards zu positionieren und den Sollwert zu erhöhen, während Sie das Signal vom Sensor des Z-Piezoaktors auf einem Oszilloskop in Echtzeit überwachen. Nachdem Sie einen stabilen wiederholbaren Z-Ansatzzyklus festgelegt haben, verringern Sie den Sollwert auf den Wert knapp über dem Instabilitätspunkt und bewegen Sie die Pipette mit einer Geschwindigkeit von etwa fünf Mikrometern pro Sekunde nach unten, bis sie die Probe erreicht. Die untere Ebene des Echtzeit-Z-Positionierungssignals nimmt zu, was darauf hindeutet, dass die Nanopipette aufgrund der Erfassung der Probenoberfläche zurückgezogen wird.
Aufgrund der ungleichmäßigen Montage auf dem AFM-Standard kann der höchste Punkt des Interessengebiets unbekannt sein. Stellen Sie daher die Amplitude des Pipettenrückzugs auf mindestens 200 bis 500 Nanometer ein. Achten Sie darauf, die obere Grenze der Z-Piezo-Aktorbewegung nicht zu überschreiten, und beginnen Sie mit der Bildgebung mit niedriger Auflösung.
Sobald der höchste Punkt der Probe im Bildgebungsbereich identifiziert wurde, verringern Sie die Hop-Amplitude und ziehen Sie die Pipette um etwa 200 Mikrometer entlang der Z-Achse zurück, um eine unerwünschte Kollision mit der Probe zu vermeiden, bevor Sie sie an eine neue X Y-Position bringen. Wenn der Interessenbereich lokalisiert wurde, beginnen Sie mit der Bildgebung mit einer höheren Auflösung. Für die auditive Haarzellbildgebung befestigen Sie ein frisch isoliertes Corti-Organ entweder mit Zahnseide oder flexiblen Glaspipetten fest in einer Kammer.
Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Kammer fest an der X Y-Piezostufe zu befestigen, und laden Sie wie gezeigt eine neue Nanopipette auf den Halter. Nachdem Sie den Nanopipettenwiderstand überprüft haben, verwenden Sie den Patch-Clamp-Mikromanipulator, um die Nanopipette über der Haarzellregion zu positionieren, während Sie das Organ der Corti X-Pflanze in einem inversen Mikroskop beobachten. Zeichnen Sie den Echtzeitstrom und das Z-Positionierungssignal auf dem Oszilloskop auf, um zu überprüfen, ob das System mit einem Sollwert von 0,5% 6 oder niedriger stabil ist, und bestimmen Sie den optimalen Sollwert und nähern Sie sich der Probe wie gezeigt.
Führen Sie eine Bildgebung der Probe mit niedriger Auflösung durch, wie unter Verwendung einer Hop-Amplitude von mindestens sechs bis acht Mikrometern demonstriert. Wenn die Nanopipette an einen neuen X-Y-Ort bewegt werden muss, ziehen Sie die Pipette um etwa 500 Nanometer ein, um eine Kollision mit hohen Merkmalen im Gewebe zu vermeiden, und wiederholen Sie die HPICM-Bildgebung mit niedriger Auflösung bis zu der Region von Interesse, in der sich die Haarzellen befinden. Stellen Sie dann die Region von Interesse mit einer höheren Auflösung in 15 Minuten oder weniger dar.
Das HPICM-Protokoll kann verwendet werden, um alle lebenden Zellen mit einer komplexen Topographie zu visualisieren, wie z. B. lebende auditive Haarzellbündel von Ratten. Trotz einer niedrigeren X-Y-Auflösung im Vergleich zu Rasterelektronenmikroskopie-Bildern können HPICM-Bilder die verschiedenen Reihen von Stereozilien erfolgreich auflösen. Die Form der Stereozilienspitzen und sogar die kleinen fünf Nanometer großen Glieder, die die benachbarten Stereozilien verbinden.
Aufgrund der berührungslosen Natur der HPICM-Bildgebung kann die kontinuierliche Zeitrafferbildgebung desselben Haarzellbündels für mehrere Stunden durchgeführt werden, ohne die Kohäsion des Bündels zu beeinträchtigen. Beachten Sie, dass das System bei einem sehr niedrigen Sollwert kleine Schwankungen im Strom als Begegnung mit der Zelloberfläche interpretieren kann, was zu einem Rauschen weißer Punkte im Bild führt. In ähnlicher Weise können große Hopamplituden die laterale Resonanz der Pipette erhöhen, was ebenfalls zur Erzeugung von verrauschten Pixeln führt.
Im Gegensatz dazu, wenn die Hop-Amplitude zu klein oder der Sollwert zu hoch ist, kann die Nanopipette mit der Probe kollidieren, was zu bildgebenden Artefakten oder Haarbündelschäden führt. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, weniger als 15 Minuten pro Haarzellbündel zu verbringen, wenn Sie mit lebenden Zellen arbeiten. Nachdem man ein Bild des Haarbündels erhalten hat, könnte man versuchen, Einkanalaufnahmen von bestimmten Stellen auf der Oberfläche der Stereozilien zu erhalten, um Fragen zu den Eigenschaften des Mechanotransduktionskanals zu beantworten.
