Teilweise durch NIH / NCRR Colorado CTSI Statt Anzahl UL1 RR025780 und den Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kernmitte Statt NIH P30NS048154 Unterstützt von NIH / wurden NIDCD R01 DC 011582. Imaging Experimente in der Universität von Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kerndurchgeführt unterstützt. Dr. Sascha du Lac aus dem Salk Institute hat uns mit den GlyT2-GFP-Mäusen.

1. Optische Genotypisierung 1. Optische Genotypisierung von Maus Pups <ol><li> Check für die Expression des jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserzeiger des geeigneten Anregungswellenlänge (405 nm in den hier beschriebenen Experimenten) und entsprechenden Filterbrille Blockierung der Anregungswellenlänge aber Passieren der Emissionswellenlänge (450 - 700 nm in den hier beschriebenen Experimente) . Richten Sie den Laserpointer auf der Rückseite des Kopfes oder das Rückenmark der Maus pup (siehe Abbildung 1). Vermeiden Aufstrahlen des Lasers in den Augen und langwierige Exposition der Haut mit Laserlicht. </li></ol> 2. Optische Genotypisierung von älteren Tieren <ol><li> Die Maus (im Alter von p14 an p138 in den hier beschriebenen Experimenten) mit einer Überdosis Pentobarbital tief betäuben durch eine intraperitoneale Injektion (120 mg / kg Körpergewicht). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Überprüfung des Tieres Reflexe (kurz Prise der Spitze the Ohr oder einem der Hinterbeine auf die Rückzugsreflex des Ohres oder Bein) hervorzurufen. </li><li> Hinweis: Trotz der Verwendung einer Überdosis Pentobarbital (120 mg / kg Körpergewicht), verweisen wir auf das Injektionsverfahren als &quot;tiefe Narkose&quot; statt Euthanasie, weil das Tier ist im Idealfall noch am Leben (dh seinen Herz noch schlägt), wenn die Chirurgie und die Durchblutung beginnen. Dies gewährleistet eine effizientere Perfusion der inneren Organe, einschließlich des Gehirns. </li><li> Sobald das Tier keine Reflexe zeigen, aufmerksam, indem sie ein Schnitt in der Haut für den Hinterkopf und Schneiden, um den Mittelteil des Schädels entfernen Sie die Haut über den Schädel (2A). Setzen Sie das aufgedeckt Schädel mit Laserlicht und beobachten die Fluoreszenz durch die Filterbrille, wie oben beschrieben. Wenn eine positive GFP-Signal beobachtet wird, fahren Sie mit Schritt 2 zweite, wenn nicht, zu opfern das Tier durch Enthauptung (/ Gewährleistung Form von Euthanasie nach unsererIACUC Vorschriften). </li></ol> Anmerkung: In noch älteren Mäusen (&gt; 1 Monat) der Fluoreszenz kann durch die Augen der Tiere beobachtet werden. 2. transkardialer Perfusion und Neuro Vorbereitung <ol><li> Perfundieren transkardial mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) unter Verwendung einer 30 G-Spritzennadel, um das Blut weitgehend entfernen das Tier. <ol><li> Zunächst öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einer scharfen Schere, und drücken Sie dann die Nadel in die linke Herzkammer. Pumpen die PBS in das Herz und die Aorta und unmittelbar nach diesem Schritt zu öffnen in den rechten Vorhof des Herzens mit der Schere, um die Blut zuzulassen, um den Körper zu verlassen. Hinweis: Perfusion dauert 5 - 10 min in Abhängigkeit von der Größe des Tieres. </li></ol></li><li> Nach dem Ausbluten durch Perfusion, enthaupten, das Tier, sichern Sie den Kopf mit Stift needles (oder 30 G Spritzennadeln) durch Durchstechen sie durch die Augenhöhlen in einer Zubereitung Schale und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel. <ol><li> Verwenden Sie zuerst eine scharfe Schere zu schneiden Sie die Haut, die über der Schädel: einen kleinen Schnitt in der Rückseite des Kopfes, dann entlang der Mittellinie auf der Rückenseite des Kopfes geschnitten, an den Seiten nur kaudal der Augen des Tieres geschnitten und schließlich Kürzung der kaudal vollständig die Klappen der Haut zu entfernen, an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Weiter, wiederholen Sie den gleichen Schnittmuster für den Schädel selbst, stellen Sie sicher, beide Kochleas in dem Prozess zu entfernen, da dies wesentlich die Entfernung der Hirnstamm am Ende zu vereinfachen. Nach diesem Vorgang ist die Schwanzgehirnhälfte sollte vollständig ausgesetzt liegen. </li><li> Im nächsten Schritt, mit einem scharfen Rasierklinge oder einem Skalpell durch den gesamten Vorderhirn in einem Winkel von etwa 45 ° und etwa 2 mm rostral aus dem Cerebellum ausgeschnitten. Scoop aus der abgetrennten vorderen Hälfte des Gehirns mit abent Spachtel. </li><li> Verwenden Sie den Spachtel, um den kaudalen Hirnhälfte an seinem rostralen Ende zu erheben und anschließend durch den Hirnnerven, die noch auf den Hirnstamm auf ihrer Bauchseite verbunden sind, geschnitten. Als Ergebnis sollte der kaudalen Hirnhälfte einschließlich des Hirnstamms frei aus dem Rest der präparierten Tier den Kopf fallen. </li><li> Klappen Sie den entfernt kaudale Hälfte des Gehirns, seine Bauchseite freizulegen und entlang der Frontalebene nur rostral geschnitten (für die anterograde Injektionen) oder einfach Schwanz (für die retrograde Injektionen) der ventral gelegen &quot;Birnen&quot;, die die trapezförmige Körper (siehe Schritt 2.3). <ol><li> Verwenden Sie immer eine scharfe Rasierklinge oder einem Skalpell für den Schneidvorgang, um den Zelltod durch übermäßige mechanische Beanspruchung des Gewebes zu minimieren. Als Endergebnis sollte ein Gehirn Explantat spannt etwa 1 cm in der Länge und mit der vollständigen oberen Olivenkomplex entlang anderen Hirnregionen erhalten worden sein. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Hinweis: Dieses Protokoll zeigt die Vorgehensweise für eine Tracerinjektion in die Trapezkörper im auditorischen Hirnstamm befindet. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Schnittebenen und Injektionsstellen nach Bedarf. Wenn die fluoreszierende Gehirnregionen von Interesse liegen nahe genug an der Hirnoberfläche, so dass sie identifiziert und ohne Schneiden des Gehirns injiziert werden kann (siehe 2B), kann der koronalen Schneideschritt weggelassen werden. <ol start="3"><li> Identifizieren Sie die trapezförmigen Körper als zwei ventralen prominente &quot;Birnen&quot;, die den ventralen Kern der Trapezkörper (VNTB). </li></ol> Hinweis: Weitere anatomischen Referenz über die ungefähre stereotaktische Position dieser Schnittebenen finden Franklin &amp; Paxinos, 2008 Steuerung 78 des Atlas, Bregma ~ -5,7 mm zeigt die mediale Kern der Trapezkörper (= MNTB) als &quot;Tz markiert &quot;. Panel 69 zeigt die ventralen Kern des Trapezes body (VNTB) als &quot;MVPO&quot; (medioventralen periolivary Kern) 19 bezeichnet. 3. Anterograde / Retrograde Tracing Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT (25 ° C). <ol><li> Nach dem Schneiden, legen den Hirnstamm Explantat in einer Zubereitung Schale mit oxygeniertem (95% O 2, 5% CO 2) Präparieren Lösung (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 0,1 mM, Glucose : 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm) und schützt sie mit 30 g Spritzennadeln. Sicherzustellen, dass der Bereich der Injektion nach oben zeigt. </li><li> Pull-Spritzen Pipetten aus Borosilikatglas und füllen sie mit einer der folgenden drei Lösungen: a) einer 1,0 mg / ml Lösung von Choleratoxin-Untereinheit-b konjugierten auf ein Fluorophor Alexa 555 in PBS 12-13 (vor allem für die retrograden Transport verwendet), b ) eine 1% -dilution in 0,9% Salzlösung von Dextran Tetramethylrhodamin 555 (3000 MW, die hauptsächlich für den retrograden Transport verwendet wird) oder c) ein 1% Herkunft des Verdünnungs in 0,9% Salzlösung von 10.000 MW Dextran-TRITC 555 (hauptsächlich für anterograden Transport verwendet wird). <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Injektionspipette Widerstände Bereich von 2,5 bis 3,5 MOhm und dass sie in 3 hergestellt - 4 Ziehen Zyklen. Für die hier beschriebenen Experimente erreichen dies durch Auswahl einer vorprogrammierten Algorithmus Ziehen an der Pipettenzieher. </li></ol></li><li> Beleuchten das Gehirn Explantat mit einem statisch montiert Laserzeiger der geeigneten Wellenlänge (Element No. 2 in 3A; 405 nm Wellenlänge in die hier beschriebenen Experimente). Verwenden Sie den Laserpointer als Leitfaden für die Injektionen, und das Ziel des Laserstrahls an der fluoreszierend markierten Hirnkern oder Zellen von Interesse, die eingespritzt wird. </li><li> Suchen und durch ein Binokular beachten Sie die beleuchtete Zielbereich beim Tragen die kompatiblen Filterbrille (450-700 nm Bandpassfilter in den hier beschriebenen Experimenten). Legen Sie die Injektionselektrode über den Mikromanipulator in das Gebiet von Interesse. </li><li> Spritzen Sie die Tracersubstanz. Die Einspritzungen bestehen aus 2 bis 10 Druckimpulse bei 15 psi für 50 msec, unter Verwendung einer Einspritzvorrichtung, die senkrecht in die Region von Interesse (ROI) gerichtet im Gehirn an. Verwalten jeder Druckimpuls in Intervallen von 10 bis 15 sec, damit der Farbstoff verteilt. </li><li> Im Fall der Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) Injektionen stimulieren zusätzlich elektrisch mit der Farbstoffaufnahme durch Elektroporation mit der Elektrode in dem Bereich des Gehirns von Interesse (MNTB und VNTB in den hier beschriebenen Experimenten) platziert zu verbessern. <ol><li> 8 verwenden TTL-Impulse von 8 Volt für 50 msec 50 msec Impulsintervallen durch einen Stimulator mit einer Stimulationsisolationseinheit (Artikel No. 7 und 9 in 3B) angetrieben wird und mit 55 V verstärkt. Verwenden von 10 bis 20 Wiederholungen dieses Protokolls VerwalNamen über mehrere Minuten 7,8. Stellen Sie sicher, um die Elektrode richtig geschliffen - das Erdungskabel sollte auf die Badlösung angeschlossen werden! </li></ol></li><li> Überprüfen Sie für den Erfolg der Injektion. Da ein fluoreszierender Tracer mit einer längeren Emissionswellenlänge wird auch Emittieren eines Fluoreszenzsignals auf die Laseranregung mit kürzeren Wellenlängen, visuell zu überprüfen, für die Farbstoffaufnahme / der eingespritzten Zielfläche verteilt, während Beleuchten der Fläche mit dem Laser und die Beobachtung durch die Filterbrille. </li></ol> 4. Inkubation <ol><li> Nach der Injektion inkubieren brainstems in oxygeniertem künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 2 mM, Glucose: 25 mM NaH 2 PO 4 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm, mit 95% O 2 eingeblasen - 5% CO 2) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) für 1 - 4 Stunden, währendder Farbstoff transportiert wird. Blasen die Lösung während der gesamten Inkubationszeit. </li><li> Anschließend übertragen die brainstems in 4% Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 für den PFA / PBS mix) und inkubieren bei 4 ° C, um nach der Fixierung über Nacht ermöglicht (O / N). </li></ol> 5. Tissue Slicing und Montage <ol><li> Am nächsten Tag, waschen Sie den Hirnstamm dreimal in PBS (5 min pro Waschschritt), bedecken Sie es in 4% Agar und dann in 50 geschnitten - 80 &amp; mgr; m dicke Scheiben auf einem Vibratom. Berg Scheiben mit Hilfe eines Montagemedium auf einen Objektträger und Deckglas. </li><li> Wahlweise kennzeichnen die Abschnitte mit fluoreszierenden Nissl für 25 Minuten (zum Beispiel blau Nissl bei einer 1: 100 Verdünnung in AB-Medien). <ol><li> Um AB Medien vorzubereiten, mischen Sie 250 ml von 0,2 M Phosphatpuffer (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml ddH 2 O und 5 g Rinderserumalbumin. </li><li> Precede und erfolgreich die Nissl Kennzeichnung Schritt 3 Waschschritten in PBS (jeweils 10 Minuten). </li></ol></li></ol> Anmerkung: Für den Fall, dickeren Abschnitten montiert werden müssen und analysiert (hier solche Scheiben beschriebenen Experimente wurden 100 bis 500 Mikrometer dick, um Axon-Verbindungen über größere Distanzen zu erhalten), kann die Technik mit Gewebe Clearing kombiniert werden. Wir fanden das ClearT2 12 erfolgreiche 20 zu sein. Wenn ein Gewebe Verrechnungsschritt enthalten ist, führen sie vor der Montage der Teile.

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Eine allgemeine Stärke in vitro Tracer Elektroporation, im Gegensatz zu in vivo Darstellung Studien ist, dass es Forschern besseren Zugang zum Gehirn Bereich von Interesse und folglich nicht teuer stereo (und oft elektro) Ausrüstung umfassen. Darüber hinaus ist die für das Gehirn Explantate erforderliche Überlebenszeit erstreckt sich über nur ein paar Stunden (1 - 4) anstelle von Tagen oder sogar Wochen im Fall von in vivo-Tracer Injektionen (siehe eine detaillierte Überprüfung auf der...

Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion 1 eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem 2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Injektionsstelle zu der Quelle eines gegebenen Vorsprungs, dh. Die Zellkörper von Neuronen, die vorstehen, sind an der Fläche) und aktive anterograde (von der eingespritzten Bereich in den Ziel einer gegebenen Projektion, d. axonalen Vorsprüngen und den axonalen Anschlüssen des markierten Neuronen) transport. Auch in einigen Fällen tracer Material in lebende Tiere, die dann überleben die Injektion von mehreren Tagen oder Wochen (in vivo Tracer Injektionen), während in anderen Fällen explantierten Gehirn injiziert werden und Inkubation für mehrere Stunden nach der Injektion in der künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit injiziert (in vitro Tracer Injektionen) . In diesem Protokoll modifizierten wir ein in vitro Elektroporationstechnik 7-8 bestehende neuronale Zellkörper und Prozesse in anterograden und retrograden Verfolgungsexperimente mit Choleratoxin-Untereinheit B und Tetramethylrhodamin Dextran als Verfolgungssubstanzen zu markieren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neurowissenschaftler mit einem effizienten Werkzeug, um neuronale Konnektivität Muster zwischen verschiedenen Hirnkerne verfolgen zu schaffen, und gleichzeitig die Vorteile der verfügbaren transgenen Mauslinien und Grund optische Geräte, um die Zielgenauigkeit beim Tracer Injektionen erhöhen. Obwohl das Verfahren der anterograden und retrograden Verfolgung mitCholeratoxin und Dextran Amin und ihre jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugaten ist nicht neu 9-13 (ebenso wie die Methode der Elektroporation, z. Haas et al. 14), die Kombination von Tracer-Injektionen mit Elektroporation in einem in vitro-Präparat mit Blöcken von Hirngewebe ist eine neuere Entwicklung 7. Sein Hauptvorteil, neuronale Verfolgungstechniken unter Verwendung der gleichen Art von Tracer Farbstoffe in lebenden Tieren ist die erhöhte Markierungsintensität, wegen der höheren Effizienz, mit der das elektroporierte Farbstoff wird durch Neuronen entnommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die verkürzte Inkubationszeit (für die Farbstofftransport erforderlich) und seine erhöhte Zielgenauigkeit während der Tracerinjektion, weil der Experimentator visuelle Kontrolle über den Zielbereich der Injektion. Letzteres bedeutet, dass auch keine teuren stereo Ausrüstung erforderlich, um den Kern oder Gehirnbereich von Interesse zu finden. Um additional erhöht Zielgenauigkeit, nutzten wir eine transgene Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen 15 und optischen Grundausrüstung, bestehend aus einem Hand-Laser-Pointer von 405 nm Wellenlänge und passenden Bandpassfilterung Brille (450 drückt - 700 nm). Somit eine erhebliche weitere Steigerung erzielten wir die Zielgenauigkeit durch die Identifizierung der Injektionsbereich durch seine Fluoreszenzsignals und durch Vorsehen einer feineren Weg für den Farbstoff Streuung in der Injektionsbereich durch Beobachtung der Wechselwirkung zwischen der indigenen GFP-Signals und der Kopierregel Fluoreszenz. Unser Verfahren ermöglicht es auch, die Funktion eines Schaltkreises zusammen mit der Konnektivität durch Identifizieren GFP-positive inhibitorische Neuronen (oder in anderen exzitatorischen Mauslinien), die mit dem Tracer gefüllt waren aufzudecken. Zusammenfassend haben wir weiter verbessert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die neuro Connectome des Wirbeltiergehirns zu studieren und zu beurteilen ter verschiedene neuroanatomische Merkmale eines gegebenen neurocircuit. Durch Verwendung von transgenen Mäusen zusammen mit preiswerten und überall erhältlich optische Geräte konnten wir die Zielgenauigkeit der Injektionen deutlich erhöhen. Darüber hinaus konnten wir die transgenen Mäuse, die Art der zurück Verbindungen, die Aufdeckung der Funktionalität einer inhibitorischen Mikroschaltung im auditorischen Hirnstamm geholfen zu identifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Präsentieren wir eine Technik, die eine in vitro-Tracer Injektionsprotokoll, das eine Reihe elektrischer und Druckimpulse verwendet, um die Farbstoffaufnahme durch Elektroporation in Gehirn Explantate mit gezielten Laserbeleuchtung und passende Filterbrille während des Verfahrens zu erhöhen verbindet. Die beschriebene Technik der in vitro-Elektroporation von selbst ergibt eine relativ gute Sichtkontrolle für Targeting bestimmter Bereiche des Gehirns. Durch die Kombination mit Laseranregung fluoreszierender genetischen Markern und deren Auslesen durch Band-Passing-Filterbrille, die abholen können die Emissionen der genetisch markierten Zellen / Kerne und der Fluoreszenz Tracing-Farbstoff, ein Forscher kann im Wesentlichen die Genauigkeit der Einspritzungen zu erhöhen von der Suche nach den interessierenden Bereich und Controlling für das Farbstoff-Ausbreitung / Aufnahme im Injektionsbereich sehr viel effizienter. Außerdem ermöglicht das Laserbeleuchtungstechnik, um die Funktionalität eines gegebenen neurocircuit Prov studierenIding Informationen über die Art von Neuronen auf einen bestimmten Bereich in den Fällen, wo der GFP-Expression in den Typ des Senders von einer Subpopulation von Neuronen verbunden vorsteht.

Die 1 und 2 zeigen, wie der Laserpointer und Laserschutzbrillen verwendet werden, um GFP-positiven Tieren schnell und kostengünstig Genotyp aus einem Wurf werden. In Fällen von jungen Maus Jungtieren kann die Technik verwendet werden, um nicht-invasiv zu identifizieren GFP Label in das Tier Gehirn durch den Schädel und die darüber liegende Haut (1A - D) werden. Emittierte Fluoreszenz durch die Haut und dem Schädel des Maus Welpen mindestens bis zur postnatalen Tag 3 (1C)</s...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Aufrufe.  University of Colorado School of Medicine.  Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen. 

Serie: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop Neuro-Roboter-Experimente zur Computational Eigenschaften Neuronale Netze Testen

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...