Pesquisa apoiada pelo Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá.

1. Introdução <ol><li> O laboratório MacIntosh vem utilizando a preparação do músculo gastrocnêmio medial durante vários anos, e antes disso, a preparação do músculo gastrocnêmio inteiro, desenvolvido com o Dr. Phil Gardiner. 1 </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Adult Sprague-Dawley (200-300 g) são tipicamente usados ​​no nosso laboratório para o estudo das propriedades contrácteis in situ. A ratazana pode ser restringida em um dispositivo de plexiglass, disponível comercialmente, ou por revestimento com uma toalha, e segurando. </li><li> Usamos cetamina / xilazina, (100 mg · ml -1, cada) misturado em 85:15, e administrar 0,1 ml por 100 g de peso de ratos por via intramuscular 2,3. Pentobarbital de sódio (50-60 mg kg -1, intraperiteneal) ou isoflurano (2-3,5%, inalada) também podem ser utilizados 4. </li><li> Embora o anestésico é com efeito, um peso preciso pode ser obtido e a esquerda do membro posterior-raspada. Esta é também uma boa time para ter certeza de todos os aparelhos eletrônicos estão ligados e prontos. Isso inclui computadores, amplificador calibre de tensão, aquecedor de óleo e outros. </li><li> Verificar se há retorno de resposta reflexa periodicamente e completar a anestesia, conforme necessário (0,05 a 0,1 ml por 100 g). </li></ol> 3. Iniciando Cirurgia <ol><li> Nós usamos uma plataforma sobre a qual plexiglass para imobilizar o rato para a cirurgia. Fita adesiva simples faz o trabalho. Certifique-se de que o animal é esticado de pata traseira esquerda para membro anterior direito. Adicionar uma gota de lubrificante para os olhos. Nós usamos óleo de parafina. Caso contrário, os olhos vão secar com anestesia cetamina. </li><li> Uma pequena luz cirúrgico é útil. Este emite calor suficiente para ajudar a manter o animal aquecido. Alternativamente, uma manta de aquecimento de água pode ser usada. Certifique-se de reflexos da córnea ou do pé pinch-estão ausentes antes de prosseguir. Técnica estéril não é necessário, pois este procedimento é agudo. O animal não vai se recuperar da anestesia. Nós eutanásia do rato com anestésicooverdose (0,2 ml, intracardíaca), quando todos os procedimentos. </li><li> A primeira incisão através da pele é a partir do calcanhar à coluna vertebral. Nós usamos uma tesoura, porque a profundidade do corte pode ser controlada e as tesouras são usadas para separar a pele dos tecidos subjacentes. Os ratos têm hemostase excelente, por isso, enquanto você evitar grandes vasos sanguíneos, hemorragia será limitado. Manter as superfícies expostas cobertos com gaze embebida com solução salina isotônica, sempre que possível. </li><li> Depois da pele é separada do tecido conectivo subjacente, a camada de músculo superficial é cortada. Tenha cuidado para não ir muito fundo, você não quer prejudicar o nervo ciático ou vasos sanguíneos, ou o músculo de interesse. Comece sobre o músculo gastrocnêmio e cortar proximalmente, ao longo da mesma linha que a incisão na pele. Debaixo do auge para localizar e evitar o nervo ciático. Depois de ver o nervo, você pode seguir seu caminho com sua incisão, mas ficar bem acima do nervo. Existe uma costura clara entre musculos. Localizar este e cortado ao longo de costuras que para o joelho. Prestar atenção e evitar vasos sanguíneos. </li></ol> 4. Prepare buraco piloto em fêmur de pino ósseo <ol><li> Corte através da fina camada de músculo sobre o aspecto caudal do fêmur, expondo o osso. Usando uma ferramenta de mão giratório, broca, ou vice-pin, (0,9 mm broca de aço carbono), faça um furo pequeno piloto através do córtex, e apenas para a medula. Não faça muito profundamente, ou sangramento excessivo irá resultar. Este buraco vai ser usado mais tarde para colocar um pino ósseo para imobilizar o fêmur na base myograph. </li></ol> 5. Isolar inervação do músculo gastrocnêmio medial <ol><li> O passo seguinte necessita de um microscópio de dissecação. Localizar o local onde o nervo poplíteo desaparece atrás do músculo gastrocnêmio medial. Delicadamente espalhar vários ramos, e cortar tudo o que não inervam o músculo gastrocnêmio medial. Inervação pode ser determinada por microestimulação. No thifase s, também certificar-se os ramos superficiais do nervo ciático são cortadas. </li><li> Agora limpar o tecido conjuntivo de distância a partir do nervo ciático, de modo que pode ser deslizado para o manguito nervo (mais tarde). Certifique-se de tratar o nervo suavemente. Qualquer trecho do nervo pode levar a inexcitability, e terminar o seu estudo prematuramente. </li></ol> 6. Isolar o tendão de Aquiles e músculo gastrocnêmio <ol><li> Dissecção romba, com a ajuda ocasional de tesoura, pode ser usado para separar o músculo do gastrocnémio de outros tecidos. O tendão do plantar pode ser puxado para fora sob o tendão de Aquiles, amarrado e cortado. O laço é meramente usada para ajudar a segurar o tendão e podem ser cortados logo após o tendão é cortado eo plantaris é separada do músculo do gastrocnémio de um comprimento substancial. Coloque uma ligadura de seda n º 1 ao redor do tendão de Aquiles, e gravata em um nó quadrado. Não puxe com muita força, ou o tendão será danificado. Usamos fórceps para cortar o osso calcan<html> eus, deixando um pequeno pedaço de osso ainda ligado ao tendão de Aquiles. Manter as superfícies de corte horizontal para garantir que o osso é cortado, e não apenas o tendão. Isso garante que o tendão de Aquiles, pode ser afixada à myograph mais tarde. </li><li> Ao longo do lado de baixo do gastrocnémio, o sóleo pode ser visto. Novamente, dissecção romba pode ser usado para separar o músculo soleus do músculo gastrocnémio. Queremos isolar os gastrocnêmio medial, por isso é o único músculo ainda está ligado ao tendão de Aquiles. Cortar o tendão sóleo, perto da extremidade distal. Depois, você pode separar os músculos gastrocnêmios medial e lateral, e cortou o tendão lateral, deixando apenas o músculo gastrocnêmio medial ligado ao tendão de Aquiles. Puxar o músculo gastrocnêmio lateral longe do medial, ao longo de cerca de 50% do seu comprimento. Para além deste comprimento, que as fibras se cruzam e danos resultarão ainda puxar. Verifique se o músculo está livre de tecido conjuntivo. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Cortar a tíbia <ol><li> Colocar uma ligadura em torno da haste, imediatamente acima do ponto médio. Isto precisa de ser apertado, sem cortar o tecido. A segunda volta antes de amarrar ajuda a evitar escorregar. Mais uma vez usar um nó quadrado para fixar. </li><li> Usando uma serra de pequena, cortar a perna de distância. Este corte deve ser no meio do caminho ao longo da tíbia. </li><li> Introduza uma sonda afiada na medula da tíbia. Esta sonda será utilizada para imobilizar a tibia na base myograph. </li><li> Anexar dois elásticos para a pele, usando grampos Michel. Estes elásticos e adicional será usada para manter a pele em torno do músculo de modo a formar um recipiente que vai ser preenchido com óleo de parafina aquecida. </li></ol> [OPCIONAL] 8. Insira cristais sonometric (etapa opcional) 5 <ol><li> Coloque o animal em uma almofada de aquecimento em baixa definição. Uma sonda rectal, se já não estiver inserido pode ser inserida neste momento. Use uma pequena gota de óleo de parafina para lubrificar. </li><li>Usando microestimulação, identificar as extremidades de um fascículo dentro do músculo. Picar uma agulha de calibre 21 para dentro do local da a origem e inserção do músculo. </li><li> Deslize um cristal sonometric no furo feito pela agulha, e de vedação com uma ligação vet-cola cirúrgica. Use uma queda muito pequena de cola, certificando-se de que ele é colocado para a direita sobre o cristal. Aplicando a cola para um pedaço de papel cortado com um ângulo agudo ajuda a aplicar a cola com precisão. Estamos colocando um cristal adicional na inserção do fascículo que foi identificado por microestimulação. </li></ol> [CONTINUA] 9. Montar no aparelho (ver figura 1) <ol><li> Posicione o rato sobre a base de myograph, com a sonda tibial orientada para a alavanca. Coloque a sonda no suporte, para imobilizar a perna. </li><li> Puxe a pele para cima nos lados, para formar um recipiente e fixar com elásticos. </li><li> Definir broca (polegada de 1/16 ª) no fêmur, com o pilotoburaco que foi criado durante a preparação cirúrgica. Certifique-se de apoiar o fêmur na porção anterior como você colocar a broca (em um vice-pin), como a quebra do fêmur pode resultar, encerra o estudo prematuramente. Apor vice-o pino a uma barra transversal para imobilizar o fêmur. </li><li> Coloque o coto distal do nervo isquiático através do manguito nervo estimulante (cátodo para o músculo) e dobra para trás próximo da origem do músculo. Ligue o estimulador para esses fios. </li><li> Fixe o tendão de Aquiles para a alavanca, que tem sensores strain gauge nele. Amarre snuggly, mas deixar algum espaço para o ajuste mais tarde. Certifique-se o alinhamento do músculo é perpendicular com a alavanca. </li><li> Encher o recipiente formado pela pele com óleo de parafina aquecida. </li><li> Ligue a lâmpada de calor e escudos de posição feitas de papel alumínio sobre a cabeça do animal, eo transdutor de força. Escudos folha adicional pode ser necessário para assegurar que a temperatura do núcleo do animal não exceed 38 ° C. O comprimento do músculo pode ser ajustada até que a folga da corda é removido a partir da conexão entre as gastrocnêmio medial e do transdutor de força. </li></ol> 10. Definir tensão máxima e comprimento de referência <ol><li> Enquanto o músculo está aquecendo, configurar o estimulador e testar a tensão de estimulação. É importante ter certeza que a estimulação é de duração de pulso muito breve. Nós usamos 50 us. Voltagem máxima deve ser inferior a 1 V. A partir de 0,5 V, a tensão aumenta até a amplitude twitch não aumenta. Tensão máxima é a mais baixa tensão que ativa todas as unidades motoras. Nós normalmente estimular o dobro da tensão máxima, ou 3 V for maior. </li><li> Normalmente, as experiências começará com o músculo no comprimento que dá a contração maior contração. Um tique é obtido com um único pulso de estimulação. O comprimento do músculo é aumentada em cerca de 1 mm para a outra contração. Isto é repetido enquanto amplitude twitchestá a aumentar. Uma vez que se contorcer diminui de amplitude, o comprimento será devolvido para o que deu o twitch maior amplitude. </li><li> Após essa configuração inicial de extensão, nós testar o sistema com o que chamam de uma &quot;contração tetânica condicionado&quot;. O estimulador é definido para fornecer pulsos de 200 Hz para 500 ms. Entrega de esta estimulação resultará numa contração tetânica completamente fundidas. A força gerada pelo músculo vai apertar todas as ligações, incluindo os nós no músculo. Depois de um descanso adequado para a dissipação de potenciação 4, o comprimento de referência do músculo é reiniciado (ver parte 9.2). Normalmente, a contração tetânica condicionado irá ter permitido algum encurtamento comprimento fascículo, de modo que o músculo terá de ser esticado um pouco para voltar para o comprimento que dá a maior contracção twitch amplitude. </li></ol> 11. Iniciar o experimento <ol><li> A experiência típica incluirá adjustm comprimentoent e / ou estimulação de uma variedade de padrões de estimulação. A coleta de dados pode envolver apenas uma força, ou força, com comprimento de comprimento, fascículo e eletromiograma. </li></ol> [OPCIONAL] 12. Força-frequência relação 2 <ol><li> Definir a duração do trem longo o suficiente para atingir um patamar de força em qualquer freqüência de interesse. A força isométrica máxima é atingida no músculo gastrocnêmio medial a 200 Hz. Duração comboio deve ser pelo menos de 200 ms, já é melhor para as frequências mais baixas, mas irá resultar em alguma fadiga se contrações vários são utilizados para determinar a gama da relação força-frequência. Nós normalmente usam contrações a 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 200 Hz. Esta gama de frequências irá permitir que a gama de frequência de a relação força-de ser descritos. Um descanso adequado entre as contrações devem ser autorizados a evitar a fadiga (1-10 min). </li></ol> 13. Força-comprimento relationship 6 <ol><li> Com o comprimento estimado óptimo estabelecido anteriormente, uma relação força-comprimento pode ser determinada de forma sistemática ajustar o comprimento do músculo de mm -4 a +4 mm usando um aparelho de servo-motor. Isto deve ser feito utilizando a estimulação máxima (200 Hz), mas verificou-se que as contracções muito breves irá produzir o mesmo comprimento real óptima 7. Contracções submáximas, como espasmos, podem ser utilizados, mas isso irá originar um diferente comprimento de dependência de força 8. </li><li> Um aspecto importante da determinação da relação força-comprimento é a necessidade de calcular a força passiva no comprimento fascículo em que a força medida ocorre. Força activa é calculada como a diferença entre a força total e a força adequada passiva. Uma vez que as estruturas elásticas paralelas suportar a força passiva e estes são, em conjunto com as estruturas elásticas da série, a contribuição força passiva a força total deve diminuir à medida que a série de ELAstic estruturas são esticadas durante uma contracção 3. Uma vez que a força passiva é conhecida por todos os comprimentos musculares relevantes, a força apropriada passivo pode ser estimado com medição contínua de comprimento fascículo usando sonomicrometry, ou estimando a conformidade do sistema de medição e as estruturas em série da unidade músculo-tendão. Se isto não for feito, o tamanho ideal das forças de preparação e de pico, são subestimadas. </li></ol> 14. Força-velocidade relacionamento 9 <ol><li> Se você gostaria de determinar a relação força-velocidade, você precisará anexar os transdutores de força a um sistema, que permite o controle de qualquer carga ou taxa de mudança comprimento. O método mais fácil e mais rentável é utilizar a pressão do ar para restringir a um encurtamento de carga controlada. No nosso sistema, o músculo está ligado à alavanca de um lado do fulcro e a alteração de pressão de ar impede o comprimento do outro lado. Um sensor de comprimento needs a ser empregada de modo que você é capaz de detectar a mudança no comprimento do músculo durante as contrações isotônicas. Este arranjo permite que as contracções afterloaded com resistência pneumática. Tanques duplos podem permitir contração isométrica com a liberação de uma carga de isotônico. Um total de 15-20 contracções devem ser obtidas, com as cargas que vão de cerca de descarregado a força isométrica máxima. Quando do ajuste dos dados a uma equação, cargas acima de 90% do isométrica não deve ser utilizado 9. </li></ol> 15. Resultados representativos: Contracções de exemplo são apresentados na Figura 2. Estas contrações foram obtidas para ilustrar a relação força-freqüência. Cálculo do pico de força ativa destas contrações, e planejar a força ativa contra a frequência, os rendimentos Figura 3, a relação força-freqüência. Os dados apresentados na Figura 2 podem ser ajustadas à equação: AF = c / (1 + e-((AF) / b) + d); AF é a força activa, F é a frequência e a,<html> b, c e d são constantes. Para o músculo gastrocnêmio medial de ratos, a freqüência média-máxima de estimulação é tipicamente 50-60 Hz em não-fatigados músculo 2. Os resultados irão encaixar estreitamente à linha descrita pela equação acima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> Figura 1 Aparelho e músculo configuração:. Pneumatic configuração é mostrada à esquerda, à direita isométrica. O sistema de alavanca mostrado à esquerda está ligado à tabela de tradução quando contrações dinâmicas são desejados (adaptado a partir de 13). O motor de passo é controlado por um computador (adaptado a partir de 14). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> . Figura 2 sobrepostos contrações isométricas: 20, 40, 60, 80 Hz, 100 e 200. A amplitude da contracção Hz 200 é 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg &quot;/&gt; . Figura 3 relação Força-freqüência: a força ativa de contrações na figura 2 são traçados ea linha representa a linha de melhor ajuste.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Resultados de boa qualidade contráteis podem ser obtidas com cuidado na preparação cirúrgica, montagem segura no aparelho e eletrônicos de boa qualidade. Quando um aluno está aprendendo esta cirurgia, alguns deslizes comuns incluem: estiramento do nervo ciático, interrompendo o fluxo de sangue, e sangramento excessivo. O nervo deve ser manuseado com cuidado para evitar danos. Poderá verificar que danificaram o nervo, se a força tetânica máxima no comprimento óptimo é substancialmente menor do que o mostrado na Figura 3, ou se a tensão de estimulação necessários para activar ao máximo todas as unidades motoras é maior do que 5 volts. É relativamente fácil para evitar que os vasos sanguíneos servindo este músculo durante a cirurgia. Interrupção desses vasos pode ocorrer quando a broca está a ser colocada na superfície do caudal do fémur. Se o orifício piloto não está sobre a superfície plana do fémur, a broca pode deslizar. Quando isto acontece, há uma possibilidade de que os vasos poplíteos são interrompidos. Sepiscinas de sangue ao redor do músculo após o set-up, é um sinal de que você tenha interrompido esses vasos. Sangramento excessivo também pode ocorrer se uma grande veia é cortada e não vinculado. Grandes veias que atente para são aqueles ao redor do tornozelo. A preparação de músculo situ é uma abordagem útil para o estudo das propriedades contrácteis do músculo. Unidades motoras individuais podem ser ativados 10, mas geralmente todas as unidades motoras são ativadas de forma síncrona. Esta é uma desvantagem em relação à activação assíncrono normal que ocorre através do recrutamento voluntário da unidade motora, por isso representa uma limitação. No entanto, no lado positivo, a activação síncrona permite a quantificação da resposta média de todas as unidades motoras. Existem duas abordagens que têm sido usados ​​para evitar a activação síncrona. Uma é a utilização de um eléctrodo de manguito com vários pares de fios de estimulantes. Isto permite a activação de uma parte das unidades motoras com cada par,e estimulação pode girar através dos pares para conseguir a ativação assíncrona. Este método de activação pode ser combinado com o bloco anódico 11 para tentar activar unidades motoras na sequência apropriada de acordo com o princípio do tamanho 12. Nesta abordagem, todas as unidades motoras são activados com um par de eléctrodos proximal, e um bloco é imposta com a estimulação de corrente directa. A amplitude do estímulo para o bloco pode ser modulada de modo a inibir as unidades motoras para o qual a activação não é desejada. Aparentemente, o bloco afeta grandes axônios ao menor tensão, e afeta progressivamente unidades menores. A preparação in situ do músculo gastrocnémio de ratos é uma ferramenta valiosa para o estudo fisiológico de contração do músculo esquelético e propriedades bioquímicas na saúde e na doença.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Cliper </td><td></td><td></td><td> Clippers animal de estimação de boa qualidade </td></tr><tr><td> Lâmpada cirúrgica </td><td> Dyna-Lume </td><td></td><td> Qualquer um dos vários fará </td></tr><tr><td> Myograph </td><td></td><td></td><td> Personalizado construído </td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Grama </td><td> S-88 </td><td> Qualquer um dos vários fará </td></tr><tr><td> Coe amplificador calibre </td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Teletermómetro </td><td> YSI </td><td> YSI-400 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma robótica </td><td> Arrick Robótica </td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador Sonometric </td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td> Computador e coleta de dados </td><td> PC com boa NIrd </td><td></td><td> Software personalizado (labview) </td></tr><tr><td> Aquecedor do bloco </td><td> Lab-line </td><td> Multi-bloco </td><td></td></tr><tr><td> Manguito nervo </td><td></td><td></td><td> Feitos </td></tr><tr><td> Microstimulator </td><td></td><td></td><td> Feitos </td></tr></tbody></table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

Há muitas circunstâncias em que é desejável para se obter a resposta contráctil do músculo esquelético, em circunstâncias fisiológicas: a circulação normal, todo músculo intacto, à temperatura do corpo. Isso inclui o estudo das respostas contráteis como posttetanic potenciação escada, e fadiga. Além disso, as conseqüências do tratamento da doença, desuso, lesão de treinamento e de drogas pode ser de interesse. Este vídeo demonstra procedimentos adequados para configurar e usar esta preparação muscular valioso. Para configurar essa preparação, o animal deve ser anestesiado, e do músculo gastrocnêmio medial é cirurgicamente isolada, com a origem intacta. Cuidados devem ser tomados para manter o sangue e suprimentos nervosas. A secção comprida do nervo ciático é limpa de tecido conectivo, e cortou proximalmente. Todos os ramos do coto distal que não inervam o músculo gastrocnêmio medial são cortadas. O coto distal do nervo é inserted a uma braçadeira revestida com fios de aço inoxidável de estimulação. O calcâneo é cortada, deixando um pequeno pedaço de osso ainda ligado ao tendão de Aquiles. Sonometric cristais e / ou eléctrodos de electromiografia pode ser inserido. Imobilização por sondas de metal no fêmur e tíbia impede o movimento da origem muscular. O tendão de Aquiles é ligado ao transdutor de força e a pele solta é puxado para cima nos lados para formar um recipiente que é preenchido com óleo de parafina aquecida. O óleo distribui o calor uniformemente e minimiza a perda de calor por evaporação. A lâmpada de calor é dirigido para o músculo, e o músculo e de rato são deixada a aquecer até 37 ° C. Durante o aquecimento, a tensão máxima e comprimento óptimo pode ser determinado. Estes são importantes condições iniciais para qualquer experiência no músculo todo intacto. O experimento pode incluir a determinação do padrão de contração, como a relação força-freqüência, força-comprimento relacionamento, e força-velocidade relacionamento. </p&gt; Com cuidado no isolamento cirúrgico, a imobilização da origem do músculo e do alinhamento da unidade musculotendínea com o transdutor de força, e a análise de dados adequado, as medições de elevada qualidade podem ser obtidas com esta preparação de músculo.

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de ratos<em&gt; In situ</em&gt;. Esta preparação permite a medição de propriedades contrácteis do músculo esquelético, em condições fisiológicas. O animal é anestesiado e o músculo é separada do tecido circundante na sua extremidade distal. O tendão de Aquiles é ligado a um transdutor de força, o que permite a medição da resposta contráctil do músculo a 37 graus C com uma circulação intacta.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.5K visualizações.  University of Calgary. Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de ratos In situ. Esta preparação permite a medição de propriedades contrácteis do músculo esquelético, em condições fisiológicas. O animal é anestesiado e o músculo é separada do tecido circundante na sua extremidade distal. O tendão de Aquiles é ligado a um transdutor de força, ...

Vídeo: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...