Diese Arbeit wurde vom National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, Schweden Research Council, Schwedisch Brain Power und Schwedisch Brain Foundation unterstützt. Vielen Dank an Mattias Karlen und Dr. Giuseppe Coppotelli für kreative Unterstützung bei der Abbildung 1 und 2 zeigen; Karin Pernold für technische Hilfe und Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson, und Nils-Göran Larsson für viele hilfreiche Ratschläge und Diskussion.

1. Tissue Vorbereitung Kryoschneiden <ol><li> Sacrifice das Tier entweder durch Genickbruch oder Enthauptung, im Einklang mit den verfügbaren ethischen ermöglichen. </li><li> Schnell sammeln Gewebe von Interesse (zB. Gehirn), und schnell auf Trockeneis (Gewebe kann Einfrieren in Isopentan oder Propan mit flüssigem Stickstoff gekühlt, um eine optimale Morphologie zu erhalten benötigen) einfrieren. Shop Gewebe in Aluminiumfolie bei -80 ° C bis zu seiner Sektion. </li><li> Embed gefrorenen Gewebe in Vorbereitung Kryoschneiden. </li><li> Sammeln Sie 14-um Kryostatschnitte bei -21 ° C (Möglicherweise müssen Temperatur einstellen ± 1-2 ° C). Thaw Schnitte auf Objektträger mit Heizblock, und speichern Sie gleitet ohne Deckglas bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. COX Histochemie <ol><li> Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur für 1 Stunde trocknen lassen. Legen Sie Folien in einer Dia-Färbung Kammer mit feuchtem Filterpapier, in Streifen schneiden. Um consistent Ergebnisse in jedem Experiment ist es empfehlenswert, maximal zehn Folien pro Experiment Prozess zu zeitlichen Verzögerungen zu minimieren. </li><li> Bereiten Sie unter einer chemischen hood 1X DAB, Cytochrom c 100 pM in 0,1 M PBS pH = 7,0. Vortex schnell. </li><li> Add 2 pg Rinder Catalase (2 pg ml -1 oder ungefähr 4 IU ml -1). Gut mischen durch Vortexen zu brechen alle Körner von Katalase. </li><li> Anwenden von 150 bis 200 ul des Inkubationsmedium zu jeder Folie, verwenden Pipettenspitze gleichmäßig auf alle Bereiche verteilt. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger für 40 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Lösung von den Folien. Waschen Sie die Objektträger 4-mal, jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS pH = 7,0. </li><li> Zurück Dias Dia-Färbung Kammer mit nassen Papierstreifen. </li></ol> 3. SDH Histochemie <ol><li> Bereiten Sie unter einer chemischen Haube 1,5 mM NBT, 130 mM Natrium-Succinat, 0,2 mM PMS, und 1,0 mM Natriumazid in 0,1 M PBS pH = 7,0. Seien Sie vorsichtig mit dem SchirmPMS vor Licht. Vortex schnell. </li><li> Apply 150-200 ul Inkubationsmedium zu jeder Folie, verwenden Pipettenspitze gleichmäßig auf alle Bereiche verteilt. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger für 40 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Lösung von den Folien. Waschen Sie die Objektträger 4-mal, jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS pH = 7,0. </li><li> Entwässern der Objektträger für 2 Minuten in den folgenden Konzentrationen von Ethanol: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Dann lassen Sie 10 Minuten in einer zusätzlichen 99,5% fort. </li><li> Die Objektträger in Xylol für 10 Minuten. Mit Entellan und Deckglas. Lassen Sie die Dias über Nacht oder mindestens 1-2 Stunden in einem gut belüfteten Ort trocknen lassen. </li></ol> 4. Bestimmung der mitochondrialen Dysfunktion <ol><li> Die Höhe der mitochondriale Dysfunktion wird durch die Menge der zellulären-Blau-Färbung dargestellt. Um halb quantifizieren diese Beträge sollten Dias codiert und visualisiert werden unter Hellfeld-Mikroskopie. Semi-Quantifizierung sollte bei einem Blind durchgeführt werden<html> Basis unter Verwendung einer Skala, zB 0-4 (0, keine blaue Färbung; 4, nur blaue Färbung). Am besten ist es, diese Art von Semi-Quantifizierung auf mehreren Abschnitten aus einem bestimmten Thema / Tier durchführen, um einen Mittelwert für jeden Probanden / Tier berechnen. </li><li> Statistik sollte mit einem nicht-parametrischen Test, wie Mann-Whitney-oder Kruskal-Wallis werden. </li></ol> 5. Entsprechende Spezifität Kontrollen <ol><li> Für Spezifität Kontrollen für COX-Aktivität, repeat &quot;COX Histochemie&quot; Schritte, und fügen 2,5 mM Natriumazid, ein Terminal Atmungskette Inhibitor. </li><li> Für Spezifität Kontrollen für SDH-Aktivität, repeat &quot;SDH Histochemie&quot; Schritte mit der Entfernung von Natriumsuccinat und die Zugabe von 50 mM Malonat, ein kompetitiver Inhibitor der SDH. </li><li> Waschen und dehydrieren Abschnitte in einem Ethanol-Serie, und dann montieren und Deckglas die Folien wie in den Schritten 3.4 beschrieben - 3,6. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: tent &quot;&gt; Das Gesamtkonzept der COX / SDH Doppel-Kennzeichnung histochemischen Assay ist in Abbildung 2 dargestellt. Repräsentative Beispiele für geeignete COX / SDH Doppel-Kennzeichnung Histochemie in Hirnschnitten von Wildtyp-und vorzeitig alternde mtDNA Mutator Mäuse sind in Abbildung 3. Die dunkelbraune Färbung in Wildtyp-Mäusen (Abbildung 3, links) zeigten normale COX-Aktivität. Cells mit Atmungskette Mängel, durch die blaue Färbung angegeben, wurden in 12 Wochen alten mtDNA Mutator Mäusen zeigten, und diese Mängel wurde weiter verbreitet als mtDNA Mutator Mäuse im Alter bis 46 Wochen (Abbildung 3, Mitte und rechts). Beispiele für unangemessene COX / SDH Doppel-Kennzeichnung in Hirnschnitten von Wildtyp-Mäusen aufgrund unzureichender COX Kennzeichnung sind in Abbildung 4 dargestellt. Unzureichende Inkubationszeit für den Nachweis der COX-Aktivität oder die Verringerung der Verfügbarkeit von molekularem Sauerstoff durch Eindecken der Folie während der Inkubation führte zu einer verminderten Ablagerung der DAB reagierenIonenprodukt und damit für die Bildung des blauen Formazan Endprodukt während der SDH Inkubation erlaubt. COX-und SDH-Aktivitäten können auch separat untersucht werden (Abb. 5, links und Mitte), jedoch ist die sequenzielle Kennzeichnung hilfreich bei der Identifizierung Zellen mit COX Mängel, aufgrund der Bildung des blauen Niederschlag während der SDH Inkubationszeit (Abbildung 3, Mitte und rechts). Spezifität Kontrollen für COX-und SDH-Aktivitäten kann auch (Abbildung 5, rechts). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mitochondrialen Atmungskette Komplexe IV. Die mitochondrialen Atmungskette ist in der inneren Membran lokalisiert und umfasst fünf Komplexe. Der Zweck der Atmungskette ist, um Elektronen aus Complex Transport I bis IV und damit es einen Protonengradienten über die innere Membran durch Complex V (ATPase) verwendet werden, um ATP zu produzieren schafft. Red Sechsecke represent-Untereinheiten durch mtDNA codiert. Weiß Sechsecke stellen Untereinheiten von Kern-DNA (beachten Sie, dass Complex II vollständig aus dem Kern-Genom kodiert) kodiert. So könnten Mutationen in der mitochondrialen Genoms verursacht Dysfunktion der Atmungskette durch Mutationen in den Untereinheiten der Atmungskette Komplexe. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg" /> Abbildung 2. Flussdiagramm der COX / SDH Doppel-Kennzeichnung histochemischen Assay. Präparieren Sie die Organe von Interesse, schnell frieren die Gewebe auf Trockeneis, und lagern Sie sie bei - 80 ° C. Sammeln Kryostatschnitte und halten bei - 20 ° C bis zur Verwendung. Lassen Abschnitte an der Luft trocknen bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Bereiten Sie das Inkubationsmedium für COX Histochemie, wenden Sie es auf den Rutschen, und inkubieren für 40 Minuten bei 37 ° C. Waschen Sie die Schnitte in PBS 4 mal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Bereiten Sie das Inkubationsmedium für SDH Histochemie, es auf die slides, und wieder für 40 Minuten bei 37 ° C inkubieren Waschen Sie die Teile wieder in PBS, in einer Ethanol-Reihe dehydrieren, und dann montieren und Deckglas den Folien. Die COX / SDH doppelt markierten Abschnitte sind bereit, unter Hellfeld-Mikroskopie innerhalb von 1-2 Stunden zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Beispiele von COX / SDH Doppel-Kennzeichnung. Hirnschnitten von Wildtyp-und vorzeitig alternde mtDNA Mutator Mäuse wurden nacheinander für COX-und SDH-Aktivitäten gekennzeichnet. (Maßstab:. 200 pm) Normal COX-Aktivität (dargestellt durch dunkelbraune Farbe) wurde im Hippocampus von Wildtyp-Mäusen (links) dargestellt. COX Mängel (angedeutet durch blaue Farbe) wurden im Hippocampus von Mäusen mtDNA Mutator (Mitte und rechts) enthüllt. Es war ein weiterer Rückgang der COX-Aktivität um 46 Wochen alt in mtDNA Mutator Mäusen, was auf weit verbreitete Verschlimmerung der Atmungskette Dysfunktion. Die beobachteten mitomitochondriale Dysfunktion in mtDNA Mutator Mäusen 12 ist durch ein hohes Maß an mtDNA Punktmutationen sowie erhöhte lineare Streichungen 5 verursacht. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für unangemessene COX / SDH Doppel-Kennzeichnung. Hirnschnitten von Wildtyp-Mäusen wurden nacheinander für COX-und SDH-Aktivitäten gekennzeichnet. (Maßstab:. 200 um) Unzureichende Inkubationszeiten (10 und 25 Minuten) für den Nachweis der COX-Aktivität führte zu einer reduzierten Abscheidung der braunen DAB Reaktionsprodukt, im Vergleich zu den 40-minütigen Inkubationszeit (links und Mitte). Die verkürzte Inkubationszeiten für die Bildung des blauen Formazan Endprodukt während der SDH Inkubation erlaubt, irreführend was auf das Vorhandensein von Zellen mit COX Mängel. Eindecken der Objektträger während der COX Inkubation führte auch zu ungenau Bildung und Ablagerung des DAB reagierenIonenprodukt (rechts). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ich ndividuelle COX-und SDH-Kennzeichnung und Spezifität zu steuern. Hirnschnitten von Wildtyp-Mäusen wurden getrennt für die COX-und SDH-Aktivitäten, durch die dunkelbraune Farbe und die blaue Farbe, bzw. (links und Mitte) gekennzeichnet sind. Obwohl COX-und SDH-Aktivitäten individuell beschriftet werden können, hat die sequenzielle Kennzeichnung erwies sich bei der Suche nach Zellen mit mitochondriale Dysfunktion vorteilhaft. Ein Beispiel für eine Spezifität Steuerung für COX-und SDH-Aktivitäten im Gehirn von einem Wildtyp-Mäusen zeigte keine Kennzeichnung (rechts). (Maßstab:. 200 um)

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die kombinierte COX / SDH histochemische Methode ermöglicht die Visualisierung von Zellen mit mitochondriale Dysfunktion. Diese Technik, die mit früheren Studien aus dem Jahr 1968, nach wie vor beliebt, mit vielen bedenkt es den &quot;Goldstandard&quot; zur Erkennung mitochondrialer Erkrankungen bei Patienten, 14,19,26,27. Es ist jetzt häufig verwendet, um mtDNA-Mutation-driven Altern und altersbedingte Erkrankungen 12,13,18,20,21,24 untersuchen. Die COX / SDH Doppel-Kennzeichnung wird häufig p...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Dry Ice </td><td> AGA Gas AB </td><td> Blockform </td><td></td></tr><tr><td> Isopentan (2-Methyl-butan) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 277258 CAS: 78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat Einbettung Lösung </td><td> Sakura Finetek </td><td> Tissue Tek 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Microm </td><td> Microm Modell HM 500M </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td> Super Frost Plus- Menzel Gläser J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser Borosilikatglas </td><td> VWR International </td><td> 16004-098 </td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> Filter Paper </td><td> Munktell Filter AB </td><td> Qualität: 1350 ArtikelAnzahl: 242 001 </td><td> 430 x 430 mm </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Sigma flüssiges Substrat System, D7304 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochrom c (Typ III, von Pferden Herz) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2506 CAS: 9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Katalase (aus Leber) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9322 CAS: 9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroblautetrazolium (NBT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N6876 CAS: 298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumsuccinat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2378 CAS: 6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td> Phenazinmethosulfat (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 CAS: 299-11-6 </td><td> PMS ist lichtempfindlich. Schild aus Licht. </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 CAS: 26628-22-8 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Xylol </td><td> VWR International </td><td> EM-XX0060-4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWR International </td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td> Malonat (Malonsäure) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1296 CAS: 141-82-2 </td><td></td></tr></table>

visualization of mitochondrial respiratory function using cytochrome c oxidase / succinate dehydrogenase (cox/sdh) double-labeling histochemistry

Mitochondriale DNA (mtDNA) Mängel sind eine wichtige Ursache von Krankheit und kann zugrunde liegen, Alterung und altersbedingte Veränderungen 1,2. Die mitochondrialen Theorie des Alterns legt eine Rolle für die Mutationen der mtDNA, die Bioenergetik Homöostase und zelluläre Funktion zu ändern, in dem Alterungsprozess 3 können. Eine Fülle von Beweisen zur Stützung dieser Theorie 1,4, ein Beispiel ist die mtDNA Mutator Maus 5 zusammengestellt worden, jedoch ist die genaue Rolle von mtDNA Schaden in alternden nicht ganz verstanden 6,7. Die Beobachtung der Tätigkeit der Atemwege Enzyme ist ein einfacher Ansatz für die Untersuchung mitochondriale Dysfunktion. Komplex IV, oder Cytochrom c Oxidase (COX), ist essentiell für die Funktion der Mitochondrien. Die katalytischen Untereinheiten der COX durch mtDNA codiert und sind für die Montage der Anlage (Abbildung 1) von wesentlicher Bedeutung. So sind richtige Synthese und Funktion weitgehend auf mtDNA Integrität 2.Obwohl auch andere respiratorische Komplexe untersucht werden konnte, sind Komplexe IV und II die meisten zugänglich histochemische Untersuchung 8,9. Complex II oder Succinat-Dehydrogenase (SDH), ist vollständig von Kern-DNA (Abbildung 1) kodiert, und seine Aktivität ist in der Regel nicht durch eine Störung der mtDNA betroffen, obwohl ein Anstieg mitochondrialen Biogenese 10-12 hindeuten könnten. Die gestörte mtDNA beobachtet in der mitochondrialen Krankheiten, Alterung und altersbedingter Krankheiten führt oft auf die Anwesenheit von Zellen mit geringer oder fehlender COX-Aktivität 2,12-14. Obwohl COX-und SDH-Aktivitäten einzeln untersucht werden können, hat die sequentielle Doppel-Kennzeichnung Methode 15,16 erwies sich bei der Suche nach Zellen mit mitochondriale Dysfunktion 12,17-21 vorteilhaft. Viele der optimalen Verfassung des Assays ermittelt worden sind, wie Substratkonzentration, Elektronen-Akzeptoren / Geber-, Zwischen-Elektronen-Carrier, Einfluss von pH-Wert, und die Reaktion time 9,22,23. 3,3 &#39;-Diaminobenzidin (DAB) ist eine effektive und zuverlässige Elektronendonator 22. In Zellen mit funktionierendem COX, wird die braune Indamin Polymerprodukt in der mitochondrialen Cristae lokalisieren und zu sättigen Zellen 22. Diejenigen Zellen, die mit dysfunktionalen COX wird daher nicht von der DAB Produkt gesättigt sein, so dass für die Visualisierung von SDH-Aktivität durch Reduktion von Nitroblautetrazolium (NBT), einen Elektronenakzeptor, zu einem blauen Formazan Endprodukt 9,24. Cytochrom c und Natriumsuccinat Substrate werden hinzugefügt, um endogene Werte zwischen Steuerung und kranken / mutierten Gewebe 9 normalisieren. Katalase ist als Vorsichtsmaßnahme, um mögliche Verunreinigung Reaktionen von Peroxidaseaktivität 9,22 vermeiden aufgenommen. Phenazinmethosulfat (PMS), einem Zwischenprodukt Elektronen-Carrier, wird in Verbindung mit Natriumazid, eine Atmungskette Inhibitor, der zur Bildung des endgültigen Reaktionsprodukte 9,25 zu erhöhen. Trotz dieser KenntnisATION, einige wichtige Details, die die Folge dieser schicklich einfache Test, zusätzlich zur Spezifität Kontrollen und Fortschritte in der Technik, noch nicht vorgestellt worden.

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Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Die Cytochrom-c-Oxidase / Natrium-Dehydrogenase (COX / SDH) Doppel-Kennzeichnung Methode erlaubt die direkte Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Enzymmangel in frisch-gefrorenen Gewebeschnitten. Dies ist eine einfache histochemische Technik und ist nützlich bei der Untersuchung mitochondrialer Krankheiten, Alterung und altersbedingte Erkrankungen.

Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

36.5K Aufrufe.  Karolinska Institutet. Die Cytochrom-c-Oxidase / Natrium-Dehydrogenase (COX / SDH) Doppel-Kennzeichnung Methode erlaubt die direkte Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Enzymmangel in frisch-gefrorenen Gewebeschnitten. Dies ist eine einfache histochemische Technik und ist nützlich bei der Untersuchung mitochondrialer Krankheiten, Alterung und altersbedingte Erkrankungen.

Serie: Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

Messatemfunktion im Maus Mit Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.