Diese Arbeit wurde von der &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; zu gewähren ANR-09-JCJC-0117-01 und &quot;Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; Zuschuss für Romain Chery. Unterstützten Wir danken Françoise Lefebvre für die Softwareentwicklung in C + + / Qt und Laurent Pinot und Batiste Janvier um Hilfe bei der Entwicklung der optischen Bildgebung Setup.

1. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung (in Einklang mit den europäischen Empfehlungen zur Pflege und Verwendung von Labortieren, 86/609/EWG Richtlinie) <ol><li> 6 bis 8 Wochen alt C57BL6 männlichen Mäusen werden betäubt mit einem Cocktail von Ketamin (10mg/kg) und Xylazin (100mg/kg) injiziert intraperitoneal. Chirurgie beginnt, wenn die Maus nicht mehr reagiert Prise Hinterpfote. Während des gesamten Experiments wird das Tier auf einem Heizkissen gelegt. Die Körpertemperatur wird kontinuierlich überwacht und bei 37 ° C. Tiefe der Narkose während der Operation und Imaging-Sitzung, indem Sie aus dem Fehlen von Gliedmaßen zurückzutreten gepflegt. Eine subkutane Injektion von 20% der anfänglichen Betäubung Cocktail ist nichts anderes verwaltet. </li><li> Mit Klipper, entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut. Reinigen Sie die unbedeckte Haut aus Rest-Haar mit steriler Gaze mit Kochsalzlösung getränkt. </li><li> Platzieren Sie die Maus in der stereotaktischen Rahmen. Die Schnauze ist in der gleichen Ebene wie die Rückseite des Kopfes werden,Um die Oberfläche des olfaktorischen Bulbus der horizontalen gesetzt. Sichere fest an Ohr und Nase Bars, um Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern. </li><li> Übernehmen Augensalbe auf die Augen des Tieres zu trocknen und Schmerzen zu verhindern. </li><li> Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 ° Ethanol und die Kopfhaut mit aufeinander des betadine. </li><li> Um die Haut über den Schädel zu entfernen, indem ein Schnitt in der Haut mit einer Schere an der Rückseite des Kopfes zwischen den Ohren beginnen. Dann auf beiden Seiten in Richtung der Basis des Ohres und in der ap-Richtung auf die Stirn entlang der Augenlider abgeschnitten. Fertig Entfernen der Kopfhaut, indem man die Haut auf der Oberseite der Schnauze dicht an die Nase bar. </li><li> Unter binokulare Beobachtung, verwenden Sie ein Wattestäbchen mit Kochsalzlösung getränkt, um sanft lösen das Periost auf der Oberseite des Schädels. Verwenden Sie eine Pinzette, um die restlichen Gewebe zu entfernen und kratzen die Oberfläche des Schädels mit einem Skalpell, um eine saubere Vorbereitung haben. </li><li>Der OB ist eine symmetrische Struktur von zwei hemibulbs, die zwischen den Augenlidern befinden sich zusammensetzen. Sie sind in der rostralen und in den kaudal durch einen venösen Sinus begrenzt, und getrennt von der Pfeilnaht. Legen Sie ein Stück aus resorbierbaren Gelatineschwamm mit destilliertem Wasser auf den Knochen über dem OB getränkt. Es ist wichtig, dass dieser Knochen Bereich feucht während des gesamten Experiments. </li></ol> 2. Vorbereiten des kranialen Fenster <ol><li> Entfernen Sie die Gelatineschwamm und starten, indem Sie vorsichtig Schaben der Knochen mit n ° 10 Skalpell. Halten Sie einen konstanten Winkel von 45 ° zwischen der Klinge und der Knochen, und bewegen Sie die Klinge von den Lidern auf die sagittale Seite der Glühbirne Bereich. Wenden Sie keine vertikalen Druck auf den Knochen oder kratzen den Knochen oberhalb des venösen Sinus. </li><li> Während der Durchforstung Prozess zu stoppen alle 5min und Ort eines hydratisierten Gelatineschwamm am Knochen zur Abkühlung der Vorbereitung. Swab den Schädel mit dem Schwamm zu Knochen Staub zu entfernen. </li><li> Keep Kehr-undKühlung alternativ bis die Visualisierung der Trabekel, die Spongiosa Schicht. Die feinen Gefäße des OB muss sichtbar sein in dieser Phase. Stoppen Sie kratzen den Knochen, und starten Sie mit dem Skalpell die Spitze senkrecht zu &quot;zeichnen&quot; einen rechteckigen Bereich umschließt der OB. Zu diesem Zeitpunkt n ° 11 Skalpell eingesetzt werden kann. Halten Sie die Operation innerhalb der Grenzen der venösen Sinus, die sicher von jedem Skalpell Schlaganfall sollte. </li><li> Dig allmählich gebildeten rechteckigen Graben durch aufeinanderfolgende Bewegungen des Skalpells. Wischen Sie die Spitze des Skalpells in regelmäßigen Abständen zu reinigen und halten Sie sie scharf. Seien Sie besonders vorsichtig von der Tiefe der Spitze zu vermeiden, berühren die Dura Oberfläche. </li><li> Um einen Eindruck von der Dicke des verbleibenden Knochens zu erhalten, drücken Sie ihn sanft mit der Spitze einer Pinzette. Wenn der Knochen Klappe Falten unter Druck, um den nächsten Schritt zu bewegen. </li><li> Unter einem Tropfen Kochsalzlösung, mit der Spitze des Skalpells horizontal ausgerichtet zu heben den Knochendeckel. Das Entfernen der Klappe ist zu tun c werdenarefully zu vermeiden Abreißen der restlichen Knochen. </li><li> Nachdem die OB-Oberfläche ausgesetzt ist, für das Fehlen von Blutungen oder Blutgefäße Anastomose zu überprüfen. Verletzung der Dura oder der Gewebeoberfläche verringert die Chancen auf optische Signale. Wischen Sie den Bereich mit einer Gelatine-Schwamm in Kochsalzlösung getränkt, um die Lampe feucht zu halten. </li><li> Übernehmen Polyacrylat Zahnzement zu einem gut auf den Knochen bilden sich rund um das Fenster. </li><li> Geben Sie einen Tropfen niedrigen Schmelzpunkt Agarose (1,2%) über die Laufzeit, und legte eine sterile Abdeckung Glas an die Abmessungen des Fensters. Während der Bildgebung Sitzung kann eine kleine Menge Agarose zugegeben, um das Austrocknen zu kompensieren. Agarose wird der OB von bewegten sich mit der Atmung zu verhindern und eine ebene Fläche für die optische Bildgebung bieten. </li></ol> 3. Optical Imaging-Setup für olfaktorische Aktivität Mapping <ol><li> Die olfaktorische Stimulation muss genau in Zeit und Intensität werden durch den Einsatz von einem Olfaktometer definiert. Wir verwenden eine benutzerdefinierte modifizierte Version des multivial Perfusionssystem Valvebank 8II aus Automatisieren Scientific mit einer grundlegenden Luftkompressor (komprimierte Atemluft wäre so gut geeignet ist) verbunden. Dieses System ermöglicht eine präzise und schnelle externe Ventilsteuerung. Lösungen von reinem Geruchsrezeptoren sind in Mineralöl bei der gewählten Konzentration verdünnt. Zur Aktivierung des dorsalen OB Aldehyde wie Hexanal werden häufig verwendet. Eine genaue Volumen des verdünnten Geruchsstoff (20 bis 50 ul) befindet sich auf einem Filterpapier geladen und in eine Spritze Reservoir. Durch die Perfusion System wird der Druck kontrolliert Luft in das System geliefert, wodurch eine konstante odoriert Luftströmung Lieferung an das Tier Nase während Ventilöffnung. Odorant wird durch eine Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) Tragluft bei einer Flussrate von ~ 1000ml/min geliefert. Vermeiden Sie die Kontamination zwischen Geruchs-und Restmengen von Geruchsrezeptoren in den Schlauch. Falls verfügbar, können die Reproduzierbarkeit der Geruchsstoff Reiz contro werdenullt durch den Einsatz von einem Flammenionisationsdetektor (microFID 2020 Photovac). </li><li> Der optische Aufbau ist eingeschaltet. Es besteht aus einem gekühlten interlaced 12 Bit CCD-Kamera (ORCA AG Hamamatsu) mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Leica MZ16), einem Computer gesteuert Olfaktometer und stabilisiert Anregungslampen mit entsprechenden Bandpass-Interferenzfilter verbunden. Ein Schema beschreibt unser Setup ist in Abbildung 2 dargestellt. Für intrinsische optische Signale Imaging (IOSI), eine 200W Halogenlampe (Oriel QTH) mit einem Faserring Licht (Schott) gekoppelt gesteckt um das Mikroskop-Objektiv verwendet werden, um stabile und gleichmäßige Ausleuchtung gewährleistet. Für Flavoprotein Autofluoreszenzsignale Imaging (FASI), ein 150W Halogenmetalldampflampe (Leica) mit einer 5mm Kernflüssigkeit Lichtleiter bieten auch lokale Anregung der Fluoreszenz durch die Auflicht-Port des Stereomikroskop. Bildaufnahme-und Hardware-Synchronisation werden von kundenspezifischer Software realisiert. Die offene suelle Software Mikromanager kann auch verwendet werden, um den optischen Aufbau und Übernahme zu kontrollieren. </li></ol> 4. Die optische Bildgebung <ol><li> Setzen Sie den stereotaktischen Rahmen unter dem Stereomikroskop, der Schädelbasis-Fenster in der Mitte des Sichtfeldes (siehe Abb.. 2A eine schematische Darstellung des optischen Aufbaus). </li><li> Tune dem Mikroskop auf die Kapillaren zu konzentrieren. Vor Stimulation Studien (siehe Beschreibung in 5) ein Bild der Lampe ist unter 560nm (grün) Licht (Faserring), die einen guten Kontrast für Blutgefäße Imaging bietet übernommen. Dieses Bild wird als eine anatomische Kontrolle verwendet werden, um den Stand der Vorbereitung zu überprüfen und erworben wird mehrmals während des Experiments. </li><li> Für IOS Bildgebung, reflektierte Lichtintensität durch die CCD-Kamera unter 630 + / -10 nm (rot) Beleuchtung aufgenommen. Die Bilder werden in Full-Frame (kein Binning) mit 5 Bildern pro Sekunde, was zu einer Belichtungszeit von etwa 150 ms entsprechen erworben. Leistung der Lichtquelle eingestellt wird, um wieder<html> ach Graustufen von mindestens ~ 3000 auf dem OB-Bereich, nahe der Sättigung des CCD Pixel Brunnen. Dies macht es möglich, die Vorteile der 12 Bit Dynamik des CCD zu ergreifen, um schwache Intensität Veränderungen bei der Aktivierung erfasst. Maximale IOS Amplituden erreichen ~ 1%. </li><li> Für FAS bildgebenden Fluoreszenz unter Anregung von 480nm + /-20nm (blau) epiflurorescence Licht erworben. Ein High-Pass-Filter bei 515 nm ist, um Licht einzufangen gesetzt. Die Bilder sind mit 5 Bildern pro Sekunde mit einer Binning von 4 mal 4, um die Empfindlichkeit zu maximieren erworben. Anregungslichtleistung ist ähnlich IOS mit Graustufen von 3000 auf dem OB-Bereich angepasst. Maximale FAS Amplituden erreichen ~ 3%. Für beide bildgebenden Verfahren ist die Schärfentiefe in der Betreff-Ebene die gleiche und wurde auf 0,5 mm für eine Vergrößerung von etwa 4-mal gemessen. </li><li> Licht sollte off zwischen bildgebenden Studien gedreht werden, um zu vermeiden Heizung und Bleichen der Zubereitung. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Imaging-Studien <ol><li> Standard-Imaging-Sitzung umfasste eine Grundlinie von 5 bis 10s, wo nur Luft zugeführt wird, gefolgt von der Duftpuls für 3 bis 10s je nach gewähltem Geruchskonzentration, und 70 bis 82s sind weiter mit einem konstanten Luftstrom, um grundlegende Erholung (Abb. aufgezeichnet 2A). Am Ende des Versuchs wird das Licht ausgeschaltet und reine Luft ist für die inter-Studie Intervalldauer geliefert (1 bis 3 Minuten) zum Auswaschen Rest Geruchsmoleküle und vermeiden sensorischen Gewöhnung. Odor Versuche wurden mit leeren Studien (Luftzufuhr) verschachtelt. </li><li> Odor-evozierte aktivierten Zonen werden visualisiert, wie etwa sphärische Bereiche auf den Karten und entsprechen der Größe der einzelnen Glomeruli (80 bis 200 um im Durchmesser 9). Bildverarbeitung ist in Abbildung 2B erläutert. Olfaktorische Karten sind in Abbildung 3 dargestellt. Im Gegensatz zu anderen sensorischen Systems, war das Signal-Rausch-Verhältnis in der OB aus, um Geruchs-evozierte Potentiale in einzelnen Studien zu lösen (Abb.. 3B für IOS und Bild. 3D für FAS). </li><li> Mäuse sind unmittelbar nach dem Ende der Bildgebung Sitzung mit Methoden in Einklang mit den europäischen Empfehlungen zur Pflege und Verwendung von Labortieren eingeschläfert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse (siehe olfaktorischen Karten in Abbildung 3): <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Abbildung 1 Strukturelle Organisation der wichtigsten Riechkolben in Nagetieren. Riechzellen, primäre Sinneszellen in der Haupt-Riechepithel befindet, drücken die gleichen Geruchsrezeptoren und konvergieren auf die gleichen Glomeruli in der OB. Olfaktorische Glomeruli, die runden Neuropile (gestrichelte Kreise), an der Oberfläche der OB entfernt. Beachten Sie, dass eine sehr dichte und komplexe vaskuläre Netzwerk vorhanden an der glomerulären Ebene ist. Abkürzungen (oben / unten): ONL: Riechnerv Schicht; GL: glomerulären Schicht, EPL: externe plexiformen Schicht; MCL:Mitral-Zellschicht, GCL: Körnerzellschicht. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Abbildung 2 Reflexions-und Fluoreszenz-Signale Aufnahme in vivo. A. Weitwinkel-optische Bildgebung Setup. Das Gehirn einer narkotisierten Maus ist entweder rot (IOS) oder blau (FAS) Licht entweder durch eine ringförmige Faserring an der Optik Linse oder ein Auflicht-Port eines Mikroskops ausgesetzt. Gerüche werden in versiegelten Ampullen geladen und odoriert Luft ist, um das Tier Nase geliefert (grünes Licht: geöffnetem Ventil). B. Die Aufnahme-Protokoll und Datenverarbeitung. IOS und FAS sind als Reihe einzelner Studien (90s Dauer) aufgezeichnet. Das Diagramm zeigt die Timeline einer einzigen Studie: baseline variiert von 5 bis 10 s, Stimulation von 3 bis 10s, und zurück auf den Ausgangswert von 70 bis 82s. Bildverarbeitung erfordert pixel-by-Pixel-Subtraktion der Intensitätswerte während der Baseline, um die Intensität Werte in Zeiten der Stimulation (für FAS) or Stimulation und wieder auf den Ausgangswert (für IOS). Diese Differenz wird dann durch Baseline-Werte aufgeteilt, um eine Veränderung in% zu erhalten (siehe resultierenden Bilder in Abb.. 3). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Abbildung 3 Odor-evozierte Aktivität Karten in der OB mit IOS und FAS Bildgebung. A. Gefäßsystem des dorsalen OB visualisiert unter grünem Licht. BC. IOS abgebildet (single-Studie versus drei gemittelten Studien jeweils) für ein 10s-Präsentation von 20% Hexanal. Weiße Pfeile zeigen die sphärische regions of interest von diesem Geruch aktiviert. Diese Aktivierung Karten wurden unter Verwendung der Frames gemittelt während der ersten Sekunde nach dem Ende des Geruchs-Stimulation (maximal Reflexion Variation -0,63% in A und -0,52% in B). Beachten Sie die schwarzen Zonen der Absorption, wo Geruch Aktivierung stattgefunden hat. CD. FAS erworben nacheinander in der gleichen Maus für den gleichen Duftstoff (single-Studie versus drei gemittelten Studien jeweiligenly). Diese Aktivierung Karten wurden unter Verwendung der Frames gemittelt während der ersten Sekunde nach dem Beginn der Geruch Stimulation (maximal Fluoreszenz Variation +0,72% in D und +0,66% in E). Beachten Sie, dass die weißen Zonen der Autofluoreszenz-Emission durch schwarze Pfeile gekennzeichnet, die schwarzen Zonen in IOS entsprechen. Die körnige Aspekt in der FAS Karte zu sehen ist aufgrund der 4 x 4 Binning für die Verbesserung der Empfindlichkeit erforderlich. FAS Bilder wurden nicht von Autofluoreszenz Bleichen korrigiert. Tatsächliche Abmessungen von Bildern BE: 0,7 mm breit x 1,2 mm lang.

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	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. 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Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Artikel präsentieren wir IOS und FAS bildgebende Verfahren zur In-vivo-Aufnahmen von Geruchs-evozierten Aktivitäten in der Maus OB. Um dieses Ziel zu erreichen eine relativ einfache und preiswerte Weitwinkel-optische Bildgebung Setup notwendig ist. Die Akquisition von Bilddaten erfordert Übung, um die feinen chirurgische Eingriffe und vermeiden Sie jegliche Verletzung der Dura oder Hirngewebe. Insbesondere wird schwerer Blutungen absorbieren Photonen für die Bildgebung erfasst und am Ende des Experiments. Ein Vorteil der IOS und FAS-Bildgebung ist die Injektion von fluoreszierenden Tracern, die in zelluläre Toxizität oder unerwünschten Nebenwirkungen führen könnten, zu vermeiden. Sie machen es möglich, Fragen über olfaktorische Karten somit räumliche Kodierung von Sinnesreizen anzugehen. Im Gegensatz zu 2-Desoxyglucose Bildgebung bieten sie die Möglichkeit, Bild mehrere Gerüche in einem einzigen Tier. Da Photonen Eindringen in das Gewebe begrenzt ist, sind IOS und FAS an der dorsalen Teil des OB beschränktund kann nicht vom ventralen Regionen aufgenommen werden. Endogene optisches Signal Imaging bietet eine ausgezeichnete räumliche Auflösung bei der in-vivo-Bildgebung. Technische Verbesserungen betreffen quantitative Berechnungen der vaskulären Komponenten in der Reflexionssignale 8,9 sowie Dynamik des Blutes mit Sauerstoff und Lautstärke während sensorische Aktivierung 10. Multiwavelength Bildgebung von IOS bildgebenden Verfahren sind derzeit in unserem Labor entwickelt, um vollständig zu quantifizieren totale Hämoglobinkonzentration und die Sauerstoffversorgung in den OB während der sensorischen Aktivierung. Diese spektroskopischen optische Messungen hinzugefügt, um FAS Bildgebung wird die Möglichkeit geben, die ungelöste Beziehung zwischen Gefäß-und intrazellulären Dynamik beim sensorischen Aktivierung 11,12 beantworten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des The Regent </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, Typ III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

Im Gehirn aktiviert sensorische Stimulation Populationen von Neuronen unter funktionalen Modulen, die die Codierung der Reiz teilnehmen verteilt. Funktionelle optische bildgebende Verfahren sind vorteilhaft, um die Aktivierung der einzelnen Module im sensorischen Kortex mit hoher räumlicher Auflösung sichtbar zu machen. In diesem Zusammenhang sind endogene optische Signale, die von molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit neuroenergetics entstehen wertvolle Quellen Gegensatz zu räumlichen Karten von Sinnesreizen über weite Felder in der Nagetier Gehirns aufzuzeichnen. Hier stellen wir Ihnen zwei Techniken, die auf Veränderungen der endogenen optischen Eigenschaften des Hirngewebes während der Aktivierung basiert. Zuerst wird die intrinsische optische Signale (IOS) werden von einer lokalen Veränderung in rot Lichtreflexion durch hergestellt: (i) Absorption durch Veränderungen in Blutoxygenierung Ebene und Blutvolumen (ii) Photonenstreuung. Die Verwendung von in vivo IOS zu räumlichen Karten aufzeichnen begann Mitte 1980 mit dem observatiauf der optischen Karten Whisker Fässer in der Ratte und der Orientierung Spalten in der Katze visuellen Kortex 1. IOS Bildgebung von der Oberfläche der Nager wichtigsten olfaktorischen Bulbus (OB) in Reaktion auf Geruchsstoffe wurde später von Larry Katz Gruppe 2 demonstriert. Der zweite Ansatz setzt auf Flavoprotein Autofluoreszenzsignale (FAS) auf Grund von Änderungen in den Redox-Zustand der mitochondrialen Stoffwechsel-Zwischenprodukte. Genauer gesagt, ist die Technik auf der grünen Fluoreszenz durch oxidierte Zustand der Flavoproteinen, wenn das Gewebe mit blauem Licht angeregt basiert. Obwohl solche Signale wurden wahrscheinlich unter den ersten fluoreszierende Moleküle für die Untersuchung der Aktivität des Gehirns durch die Pionier-Studien von Britton Chancen und Kollegen 3 aufgezeichnet, war es bis vor kurzem nicht, dass sie für die Kartierung des Gehirns Aktivierung in vivo verwendet worden sind. FAS Bildgebung wurde zum ersten Mal den somatosensorischen Kortex bei Nagetieren als Reaktion auf Hinterpfote Stimulation durch Katsuei Shibuki Gruppe 4 aufgebracht. Das olfaktorische System ist von zentraler Bedeutung für das Überleben von der überwiegenden Mehrheit der Lebewesen, weil es effiziente Detektion und Identifizierung von chemischen Stoffen in der Umwelt (Nahrung, Räuber) ermöglicht. Der OB ist die erste Staffel von olfaktorischen Informationsverarbeitung im Gehirn. Er empfängt afferente Projektionen aus dem olfaktorischen primären sensorischen Neuronen, die flüchtigen Duftmoleküle erkennen. Jede Riechzelle drückt nur eine Art von Geruchsrezeptoren und Neuronen tragen die gleiche Art von Rezeptor schicken ihre Nervenfortsätze die gleiche, wohldefinierte Mikroregionen von ~ 100 um 3 gebildet aus diskreten Neuropil, die olfaktorische Glomeruli (Abb. 1). In den letzten zehn Jahren hat IOS Abbildung der funktionalen Erforschung des OB 5, 6, 7, die sich zu einem der am besten untersuchten sensorischen Strukturen unterstützt wurde. Die Abbildung von OB Aktivität mit FAS Bildgebung wurde noch nicht durchgeführt. Hier we zeigen die aufeinanderfolgenden Schritte eines effizienten Protokoll für IOS und FAS Bildgebung durch Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus OB Karte.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Dieser Artikel stellt die Protokolle der intrinsischen optischen Signalen und Flavoproteinen Autofluoreszenzsignale Bildgebung zur Karte Gerüche hervorgerufene Aktivitäten auf der Oberfläche der Riechkolben bei Mäusen.

Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Aufrufe.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Dieser Artikel stellt die Protokolle der intrinsischen optischen Signalen und Flavoproteinen Autofluoreszenzsignale Bildgebung zur Karte Gerüche hervorgerufene Aktivitäten auf der Oberfläche der Riechkolben bei Mäusen.

Serie: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

Die gleichzeitige Auswertung der zerebralen Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften der<em&gt; In Vivo</em&gt; Rattenhirn Mit Multispektral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...