Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder (NIH / NIDCD 009269, 012831 und ARRA administrative Ergänzung NIH Zuschüsse) zu Weihong Lin unterstützt. Wir danken besonders Herrn Tim Ford bei UMBC für seine technische Unterstützung bei Videoaufnahmen und Bearbeitung. Wir möchten auch Dr. Daphne Blumberg, Ms. Chere Petty bei UMBC und Mr. Nicholas McCollum von Olympus America Inc. danken für ihre Unterstützung bei der Ausrüstung Videoaufnahmen.

1. Maus Nose Vorbereitung Wir verwendeten erwachsenen C57BL / 6 Hintergrund Mäuse in dieser Studie. Alle Tierpflege und Verfahren werden durch die Animal Care und Use Committees (IACUC) der University of Maryland, Baltimore Landkreis genehmigt. 1.1 Der Erwerb der Nase aus paraformaldahyde fixierten Mäusen <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Bones Schädel einer Maus A:. Dorsale Ansicht des Schädels B:. Ventralansicht des Schädels mit dem Unterkiefer entfernt. Der Schädel wurde aus einer 40 Tage alten Maus hergestellt. Einzelne Knochen werden zur besseren Visualisierung gefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol><li> Perfundieren transkardial einzelnen Mäusen nach th behebene Protokoll von Lin et al., (2008) 16. Kurz gesagt, wurden die Mäuse tief narkotisierten mit Tribromethanol (Avertin 250 ug / g Körpergewicht), transkardial mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, 30-50 ml), gefolgt von einem Phosphat gepufferte Fixiermittel perfundiert mit 3% Paraformaldehyd, 19 mM L-Lysin monohydrochloride und 0,23% Natrium-m-Perjodat (ca. 35-50 ml). Man kann auch die Schritte in der JoVE Artikel für Tier Perfusion 35. </li><li> Verwenden Sie eine Schere abzuschneiden Unterkiefer (oder der Unterkiefer) und entfernen Sie die Haut auf dem Kopf. </li><li> Trennen der gesamte Kopf vom Rest des Körpers. </li><li> Entfernen Sie den Gaumen. Außerdem reinigen und entfernen Sie die restlichen Bindegewebe und Muskulatur auf der Oberfläche des Schädels, um die Probe in den 1A und 1B gezeigt bekommen. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie die Schädelknochen, die das Gehirn und Riechkolben. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe und Knochen. Keinete, für den erweiterten Gewebe Vorbereitung, in der das Gehirn und Nase verbunden bleiben, werden nur die Schädelknochen entfernt. Für immunhistochemische Untersuchungen wurde das Gewebe für 1,5 h nach befestigt und in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 25% Saccharose über Nacht. Nasal Gewebe sollte gehalten befeuchtet werden während der Präparation durch Eintauchen in das gepufferte Saccharose-Lösung mehrmals. </li></ol> 1.2 Der Erwerb der Nase frisch eingeschläfert Mäuse <ol><li> Einzelne Mäuse wurden auf eine saubere Käfig übertragen und belichtet, um CO 2-Gas, das durch Genickbruch 5 min nach dem letzten Atemzug folgte. Um das Blut in der Nase Gewebe zu reduzieren, verwenden Sie eine Schere, um die Truhe zu öffnen und schneiden das Herz, damit das Blut abfließen kann. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 bis 1.1.5, mit Ausnahme der Post-Fixierung und Kryokonservierung mit 25% Saccharose. Die Probe sollte gehalten befeuchtet und gewartet werden mit Kochsalzlösung mit Tyrode (in mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 Na-Pyruvat, 10 D-Glucose und 10 N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure-Puffer (HEPES, eingestellt auf pH 7.4). Alternativ faltet ein Stück Kimwipes, tränken sie mit Tyrode-Lösung und Ort unter der Probe während Sezieren und gelegentlich tauchen die Probe in der Tyrode-Lösung oder einige Tropfen Lösung auf das Gewebe zu halten befeuchtet, um die Lebensfähigkeit der Zellen und Gewebe zu erhalten . </li></ol> 2. Schneidezahn, Vordere Vomer und Oberkiefer Knochen Removal <ol><li> Starten Sie von einer ventralen Sicht. Suchen Sie die vomer Knochen und brechen die Knochen vomer entlang seiner Länge mit einer Zange oder Pinzette mit Zähnen, um die meisten ventralen Teil des Knochens zu brechen. </li><li> Mit gezackten Zange, entfernen Sie die defekte Segmente des vomer Knochen sanft Aufdrängend die Knochenfragmente vom Vomeronasalorgan (VNO). Hinweis für Mäuse weniger als einen Monat alt, oder wenn nur Interesse an der MOE, diese beiden steps übersprungen werden. </li><li> Halten Sie den Kopf fest mit einer Pinzette. Verwenden Sie die Zange, um den vorderen Teil der beiden Schneidezähne und der Region verbunden Frontzahnbereich des Oberkiefers zwischen den beiden Schneidezähnen und dem vomer Knochen brechen. </li><li> Brechen Sie den ventralen Teil des rechten Oberkiefers in dem Bereich knapp vor der Jochbogen bis zur Höhe der Rückenflosse Jochbein Platte. </li><li> Flip über die Nase für eine Rückenflosse Sicht. Verwenden Sie die Zange, um den vorderen rechten Oberkiefer des dorsalen Platte Jochbein zu brechen. Der gesamte vordere rechten Oberkiefer des Jochbein Platte sollte locker sein. Verwenden Sie die feinen Pinzette vorsichtig trennen jede Nasengewebe zugrunde liegenden Oberkiefer, und dann sanft abhebt das Knochenstück. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 auf der linken Schneidezahn und linken vorderen Oberkiefer Lösen und entfernen Sie sie nach dem Nasenbein entfernt wurde. </li></ol> 3. Nasenbein und Jochbein Dorsal Plattenentnahme <ol><li> Verwenden Sie die gezackten Zange oder die Zange wiederBewegen Sie den Rest der Stirnbeine nur kaudal der nasalen Knochen. Nach dem Entfernen dieses Stück Knochen, kann der kaudalen Teil des Nasenbein mit einer Pinzette gegriffen werden. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um den vorderen Teil des Jochbogen, die dem Jochbein Platte angeschlossen ist zu brechen. </li><li> Nehmen Sie die feinen Pinzette am seitlichen Rand der dorsalen Ende des Jochbein Platte und vorsichtig drehen die Knochen und entfernen Sie es. Wenn der Knochen nicht locker ist, verwenden Sie die Zange, um es vorsichtig spannen, um es für die Entfernung zu lockern. </li><li> Verwenden Sie die feinen Pinzette oder einer Rasierklinge die mediale Naht zwischen der rechten und linken Nasenbein lockern. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um die gezackten kaudalen Ende der rechten Nasenbein greifen. Bewegen Sie die Knochen von einer Seite zur anderen, um sie vom darunter liegenden Gewebe zu trennen. Es ist sinnvoll, die Zange entlang der kaudalen Drittel des Nasenbein bewegen zum Bewegen der Knochen einer Seite zur anderen. Wie das Nasenbein trennt, langsam heben die Knochen aus dem kaudalen Ende. </li><li> Während ter Nasenbein leicht angehoben wird, kippen die Knochen seitlich zu einer seitlichen outcropping des Knochens, die mit dünnen respiratorischen Epithel ausgekleidet ist zu offenbaren. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen dieses Gewebe aus dem Nasenbein. Fahren Sie mit dem Nasenbein heben. Wenn der Knochen vollständig vom darunter liegenden Gewebe getrennt, mit einer Schere abgeschnitten Nasenbein am rostralen Ende. </li><li> Die Schritte 3.1, 3.5 und 3.6 für die Entfernung von links Nasenknochens. </li><li> Die Schritte 3.2 und 3.3 für die linke Seite der Nase. </li></ol> 4. Lateral Jochbein Plattenentnahme <ol><li> Entfernen Sie das Jochbein Platte einen Seite zu einem Zeitpunkt. Entweder Jochbein Platte zuerst entfernt werden. </li><li> Von einer ventralen Sicht brechen die Oberkiefer schlechter als die Jochbogen bis zum Bruch der Jochbogen erreicht. </li><li> Von einer dorsalen Sicht vorsichtig greifen die Jochbogen und heben Sie Vorderkante und den seitlichen. Wenn das Jochbein Platte ist immer noch zu jedem Gewebe befestigt ist, nehmen Sie die feinenZange und sanft die Verbindungen trennen, zwischen dem Gewebe und dem Knochen. </li><li> Wiederholen Sie für die Jochbein Platte auf der anderen Seite der Nase. </li></ol> 5. Orbit Knochen Removal <ol><li> Von einer ventralen Sicht brechen die Knochen palantine zwischen den Backenzähnen der Nase. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um die 3 Backenzähne und der Oberkiefer auf jeder Seite der Nase zu brechen. </li><li> Brechen und entfernen Sie alle verbleibenden dicke Stücke von Knochen ventralen und posterioren den Nasenmuscheln auf jeder Seite der Nase. </li></ol> 6. Siebbeins Removal <ol><li> Brechen Sie einen beliebigen Teil der Siebbein vorstehende kaudal der Nasenmuscheln. Dies ist notwendig, um den Verlust der Nasenmuschel Gewebe zu vermeiden beim Abnehmen dünne Stücke des Siebbein Abdecken der Nasenmuscheln. </li><li> Für die rechte Seite der Nase, legen Sie die feinen Pinzette an der vorderen Kante des Siebbein und sanft entfernen. Wenn ein Teil des Knochens bleibt, wiederholen Sie den Vorgang, bis alleder dünne Knochen bedeckt die Nasenmuscheln entfernt wurde. Die Nasenmuscheln nicht brauchen, um in den meisten Präparaten entfernt werden. In alten Mäusen, wird der Siebbeinplatte spröde. Wenn Kryoschneiden der nasalen Gewebe benötigt wird, entfernen Sie kleine Stücke von der Platte mit feinen Pinzette, um den möglichen Schaden durch die Knochen zu reduzieren. </li><li> Wiederholen Schritt 6.2) für die linke Seite der Nase. </li><li> Entfernen Sie alle restlichen Knochenfragmente vor dem Schneiden. Hinweis: bei Tieren mehr als ein Jahr alt, der posterodorsal Bereich des Septum Knochen ist etwas dick und hart. Man kann diesen Teil entfernen mit feinen Pinzette. Führen Sie die Spitze der Zange in beiden Seiten des Knochens an die dorsale Abschnitt des Septum Knochen und dem Futter Epithelgewebe trennen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen zu greifen und halten Sie die Probe. Verwenden Sie eine andere Pinzette, um den oberen knöchernen Teil aus dem unteren Teil der knorpeligen Nasenscheidewand brechen und entfernen Sie sie. </li></ol><ol><li> Richten Sie den Sauger Vakuumpumpe. </li><li> Legen Sie die Nase in einer Einbettform. Tauchen Sie die Nase in OCT Medien. </li><li> Verwenden Sie einen Staubsauger, um Luftblasen in der Nase Gewebe gefangen zu entfernen. Dieser Vorgang dauert bis zu 5 min. </li><li> Nach Entfernen von Luftblasen, stellen das Gewebe in der gewünschten Orientierung. </li><li> Frieren Sie das OAT und Gewebe in der Form unter Verwendung von Trockeneis. Das eingebettete Gewebe kann dann sofort kryogeschnitten oder bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol>

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R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir gezeigt, eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Isolierung von intakten olfaktorischen und respiratorischen Gewebe aus der Maus Nase durch sequentielles Entfernen der umgebenden Knochen unter Schonung des Gewebes unterhalb. Wir zeigen, dass eine sorgfältige Entfernung von Knochen können sogar die zartesten Gewebe in ihrer Gesamtheit zu bewahren. Wir teilen auch Einblick in mögliche Modifikationen dieser Technik, in denen wir isolieren sowohl das Gehirn und Nase Gewebe zusammen, um die Nerven zu bewahr...

Der Säuger Nasenhöhle umfasst verschiedene Arten von Geweben und Organen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen. Die Nasenhöhle bildet den Eintrag des oberen Atemwege, der Luftfahrt kann in die und aus der Lunge. Inhalierten Luft durch die Nasenhöhle, wo es einer Temperatur-und Luftfeuchtigkeits-1 sowie die Reinigung oder Filterung reizende und toxische Stoffe und infektiöse Mikroorganismen 2 zu entfernen. Beide Behandlungen werden von nasalen Epithelien und subepithelialen Gewebe, einschließlich Drüsen und Gefäßen durchgeführt und sind entscheidend für den Schutz der unteren Atemwege und die Lunge. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Atmung und epithelialen Abwehr, die nasale Gewebe enthält auch periphere sensorische Geräte der Geruchs-und Trigeminus-Systeme, die eine breite Palette von chemischen Substanzen zu erkennen in der durchströmenden Luft. Je nachdem, welches System aktiviert ist, können sensorische Erkennung von Chemikalien in der Nase zu entlocken entwederein Gefühl der Geruch, Reizung oder Schmerzen 3,4. Die periphere olfaktorische System ist komplex und besteht aus mehreren anatomisch getrennt olfaktorischen Sinnesorgane innerhalb der Nasenhöhle gemacht. Unter ihnen ist die wichtigste olfaktorischen Epithel (MOE) die größte, die bis macht etwa 45-52% der nasalen Epithelien in Nagetieren 5 und wird in der hinteren Region. Im anteroventral Region, gibt es ein Paar von röhrenförmigen Strukturen Vomeronasalorgan 6, die entlang jeder Seite der Nasenscheidewand sitzen bekannt. Zwei weitere kleine Gruppierungen von Riechzellen, als Septalorgan von Masera 7,8 und dem Gruneberg Ganglion 9 bekannt, wohnen zusammen das ventrale Septum und die dorsale Eingangsbereich der Nasenhöhle, beziehungsweise. Diese peripheren Organen enthalten Neuro-Epithelien mit Besonderheiten in der Morphologie, Zell-Marker Expression und physiologische Funktion. Gemeinsam erkennen sie Tausende von GerüchenMoleküle mit exquisiten Empfindlichkeit 10-12. Zusätzlich zu den olfaktorischen Organe, die Nasenhöhle beherbergt auch andere Sinnesorgane. Es ist bekannt, dass peptiderge Trigeminus Fasern in der Nasenschleimhaut, insbesondere das respiratorische Epithel 13,14 sind. Einige dieser Fasern erkennen reizende und giftige Chemikalien und sind verantwortlich für die Initiierung Schutzreflexe wie Husten und Niesen 4,15. Reizt Geruchs-und Bitterstoffe kann auch durch eine kürzlich entdeckte Population von einsamen chemosensory Zellen (SCC), von denen viele von Trigeminus Fasern 16-19 innerviert werden erkannt werden. Diese SCCs sind in höherer Dichte im Eingangsbereich der Nasenhöhle und vomeronasal Eintrag Leitungen befindet, deutete an, dass sie auch dazu dienen, eine Schutzfunktion 16-18. Somit kann Nasenepithelien wesentlichen unterscheiden sich in Funktion, Morphologie und Zell-Zusammensetzung in Abhängigkeit von ihreranatomischen Stellen. Selbst innerhalb eines einzelnen und spezialisierten Epithel, gibt es regionale Unterschiede. Die MOE ist ein solches Beispiel. Die MOE-Linien verschiedene Nasenmuscheln, die kompliziert und sind gewellt Strukturen. Wegen ihnen verschiedenen Regionen der MOE Erfahrung unterschiedlichen Luftmengen und somit unterschiedliche Diffusion und Clearance-Raten in der Luft Geruchsmoleküle 20. Es ist auch bekannt, dass Riechneuronen (OSN) Expression eines bestimmten Geruchsstoff-Rezeptor in einer von vier Zonen umgangen der MOE 21,22 befinden. Wie dieser Unterschied wirkt Lage eines OSN Antwort auf Duftstoffe weitgehend nicht bekannt. Darüber hinaus zeigen einige OSN Populationen regionalen Vorlieben. Guanylylcyclase-D (GC-D)-exprimierenden OSNs haben zonale Ausschüttungen zugunsten der Cul-de-sac Regionen der ectoturbinates 23,24. In jüngerer Zeit fanden wir eine Subpopulation von kanonischen OSNs die transient receptor potential Kanal M5 drückt (trpM5) und wird vorzugsweise in der lateralen und ventralen Bereiche 25 befinden. Diese Ergebnisse zeigen, dass MOE ist nicht einheitlich. Allerdings ist, wie diese regionalen Unterschiede olfaktorischen Codierung beeinflussen nicht verstanden. Dies ist zum Teil, weil gründliche physiologische Untersuchung der MOE und die Nase ist durch die Schwierigkeiten bei der Beschaffung intakt Nasenepithelien mit erhaltenen anatomischen Organisation mit aktuellen Methoden beschränkt. Die Nasenepithelien werden überwiegend von den vorderen Knochen des Schädels, einschließlich der nasalen, Oberkiefer, Palatin, Jochbein und ethmoid Knochen umgeben. Bei erwachsenen Mäusen und anderen Nagetieren Modelle, sind diese Knochen hart und schwierig, ohne eine Beschädigung der in enger Beziehung Nasengewebe, insbesondere die empfindliche Nasenmuscheln entfernen. Oft wird auf chemischer Basis zur Entkalkung Knochen erweichen, damit Kryoschneiden von Nasalgewebe für morphologische, immunhistochemische und in situ Hybridisierung Studien, jedoch Abhängigkeitding auf dem Alter des Tieres, kann die Entkalkung dauern über Nacht bis zu 7 Tage 24,26-28. Diese Behandlung ist auch begrenzt, da es erfordert Gewebes Fixiermittel erhalten. Darüber hinaus können chemische Entkalkung hart sein und Einfluss auf die Immunmarkierung von einigen empfindlichen Antikörper 29,30. Aus physiologischen Studien wird lebendes Gewebe erforderlich, und somit diese Versuche sind oft auf isolierte OSNs oder MOE Scheiben von Neugeborenen, deren Schädelknochen sind dünn und weich 17,31,32 erzielt worden. Physiologische Untersuchungen können auch nutzen whole mount Präparaten durch Spaltung des Kopfes 25,33,34, aber in der Regel nur die mediale Oberfläche der Nase ist leicht zugänglich, die Begrenzung physiologischen Aufnahmen auf anderen Gebieten. Hier beschreiben wir eine wirksame, manuelle Methode zur Zerlegung intakt Nasalgewebe mit erhaltenen ursprünglichen anatomischen Organisation und Morphologie vorzubereiten. Wir nacheinander entfernen Sie die wichtigsten Knochen des vorderenSchädel unter einer Dissektionsmikroskop eine fast völlig intakt Nasenepithel aussetzen, während die dünnen Nasenmuscheln intakt, es sei denn die Mäuse sehr alt sind und Kryoschneiden benötigt wird. Wir verlängern auch die Methode, um die Verbindung zwischen den nasalen Gewebe und Riechkolben, sowie den Rest des Gehirns zu erhalten und ermöglicht so die gleichzeitige Prüfung von sowohl peripheren und zentralen Schaltungen. Unsere Methode kann verwendet werden, um vorzubereiten Paraformaldehyd-fixierte, sowie frische, Live Nasengewebe werden. So ist unsere Methode zu erwarten morphologische, immunhistochemische und physiologische Untersuchungen der Atmung, Geruchssinn und nasal Schaden und Krankheit zu erleichtern.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

Das Säugetier Nase ist ein multifunktionales Organ mit komplizierten inneren Strukturen. Die Nasenhöhle ist mit verschiedenen Epithelien wie Geruchs-, Atmungs-und Plattenepithel die sich deutlich in anatomischen Stellen, Morphologie und Funktionen ausgekleidet. Bei erwachsenen Mäusen wird die Nase mit verschiedenen Schädelknochen bedeckt, die Begrenzung experimentellen Zugang zu den internen Strukturen, vor allem diejenigen in der hinteren wie die wichtigsten olfaktorischen Epithel (MOE). Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Gewinnung fast die gesamte und intakte Nasalgewebe mit erhaltenen anatomischen Organisation. Mit chirurgische Instrumente unter einem Binokular, wir nacheinander entfernen Sie die Schädelknochen rund um die Nasen-Gewebe. Dieser Vorgang kann auf beiden Paraformaldehyd-fixierten und frisch seziert, gehäutet Maus Köpfe durchgeführt werden. Der gesamte Vorgang dauert Zerlegung etwa 20-30 min, die deutlich kürzer als die experimentelle Zeit für herkömmliche chemische-basierten de erforderlich istVerkalkung. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um Luftblasen zwischen Nasenmuscheln, die kritisch für den Erhalt intakter dünnen horizontalen oder koronalen oder Sagittalschnitten vom Nasengewebe Vorbereitung ist gefangen zu entfernen. Nasal Gewebe unter Verwendung unserer Methode kann für whole mount Beobachtung des gesamten Epithelien sowie morphologische, immunozytochemische, RNA in situ Hybridisierung und physiologische Studien verwendet werden, insbesondere in Studien, in denen regional spezifische Prüfung und Vergleich von Interesse sind.

Mit dieser Methode können wir zuverlässig erhalten fast vollständig intakt Nasengewebe. 2A zeigt ein Bild von erwachsenen nasal Probe aus einem Paraformaldehyd-fixierten Kopf. In dieser Probe sind alle vier Sub-olfaktorischen Sinnesorgane, einschließlich der MOE, Septalorgan, die Gruneberg Ganglion und VNO, intakt. Außerdem sind die Atemwege Epithelien und subepithelialen Gewebe, wie Drüsen und Gefäße erhalten. Wir haben erfolgreich diese Methode in einer Reihe von Studien, in denen wir untersuc...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Eine effektive Methode, um Manuelle Zerlege Intact Maus Nasengewebe mit erhaltener Anatomische Organisation vorbereiten

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.5K Aufrufe.  University of Maryland Baltimore County. 

Serie: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Forschung

Biologie

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Mausmodell der Lungenfibrose, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

Ein Mausmodell der Lungenfibrose, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial information for understanding the mechanism of diseases and designing treatments. In this work, we describe procedures and methodologies for studying in-cell metabolic activity in a retrogradely perfused mouse heart in real-time. The heart was isolated in situ,&#160;in conjunction with cardiac arrest to minimize the myocardial ischemia and was perfused inside a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer. While in the spectrometer and under continuous perfusion, hyperpolarized [1-13C]pyruvate was administered to the heart, and the subsequent hyperpolarized [1-13C]lactate and [13C]bicarbonate production rates served to determine, in real-time, the rates of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase production. This metabolic activity of hyperpolarized [1-13C]pyruvate was quantified with NMR spectroscopy in a model free-manner using the product selective saturating-excitations acquisition approach. 31P spectroscopy was applied in between the hyperpolarized acquisitions to monitor the cardiac energetics and pH. This system is uniquely useful for studying metabolic activity in the healthy and diseased mouse heart.

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

We describe an experimental setup for administrating hyperpolarized 13C-labeled metabolites in continuous perfusion mode to an isolated perfused mouse heart. A dedicated 13C-NMR acquisition approach enabled the quantification of metabolic enzyme activity in real-time, and a multiparametric 31P-NMR analysis enabled the determination of the tissue ATP content and pH.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie