Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR) hibe ve Crohn ve Kanada Kolit Vakfı (CCFC) tarafından desteklenmektedir.

1. DSS-bağlı akut kolit murin model <ol><li> Istenen nihai konsantrasyonu (% 1-5) (wt / vol) (yani,% 5 DSS çözüm otoklava su 500 ml için 25 mg DSS toz eklemek için) otoklavlanmış içme suyu dekstran sülfat sodyum (DSS) ekle . Stok çözelti ° C kadar bir haftaya kadar ya da 4 oda sıcaklığında bırakılabilir. </li><li> Biyogüvenlik kaputu, stok DSS çözüm 50 ml Falcon tüpleri (kafes ortalama gerekli bir) içine dökün. Gerekli stok solüsyonu tüplere dolum tutun. </li><li> DSS solüsyonu (50 ml Falcon tüpleri) ile her bir fare kafes içme suyu değiştirin (süresi kullanılan DSS rejimine bağlı olacaktır. Örneğin, 6-8 haftalık erkek C57BL / 6 fareler kullanarak, biz yönetmek toplam beş gün için% 5 DSS çözüm). Fare, başka bir su kaynağı girişi olmaması gerekir. Kontrol farelerde DSS olmadan otoklavlanmış içme suyu verilmiştir. </li><li> Günlük fareler tartılır ve DSS Hergün tüketilen miktarı kayıt. Her TopDSS seviyeleri kaydettikten sonra 50 ml şişe. Bu deney süresi boyunca fare başına düşen kafes başına tüketilen DSS yaklaşık hacmini ölçmek için. Çalışmalarda, erkek C57BL / 6 farelerinde ile 5 gün süreyle% 5 DSS çözüm kullanın. Önemli kilo kaybı, değişen dışkı kıvamı ve fekal kan bulguları bu özel DSS rejimi ile 3 gün gibi erken görülür. DSS yönetimi sırasında, fare, bir hayvan olduğunu ya da önemli fizyolojik göstergesi olarak belirgin kilo kaybı, dehidratasyon ve ishal ile kilo kaybı ile ilk ağırlığının% 20&#39;den fazla sergi (5. günde ilk ağırlığının yaklaşık% 5-10) sonlanma noktası yakın. Hayvan% 5 DSS 5 gün sonra normal suya erişim verilirse, 7 gün içinde iyileşir. Tüm deneyler kurumun hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve onaylı Hayvan Kullanımı Protokolü (AUP) uygun olması gerekir. </li><li> Deney süresince, bir hastalık aktivite indeksi (DAI)skoru kolit klinik ilerlemesini değerlendirmek için değerlendirilebilir. DAI, başlangıç ​​ağırlığı, dışkı kıvamı ve kanama ile karşılaştırıldığında kilo kaybı kombine puan. Puanlar şöyle tanımlanmıştır: kilo kaybı: 0 (kaybı), 1 (% 1-5), 2 (% 5-10), 3 (% 10-20) ve 4 (&gt;% 20), dışkı kıvamı: 0 (normal), 2 (gevşek dışkı), 4 (ishal) ve kanama: 0 (kan), 1 (Hemoccult pozitif), 2 (Hemoccult olumlu ve görsel pelet kanama) ve 4 (brüt kanama, kan etrafında anüs). DAI DSS tedavi süresince günde atılır. </li><li> Istediğiniz zaman noktada, tartmak ve fareler kurban. Fare kurumun hayvan tesis tarafından onaylanan izofluran veya başka bir yöntem teneffüs ettikten sonra servikal dislokasyon ötenazi olabilir. </li></ol> 2. Kolonik doku numunelerini <ol><li> Açığa hayvan ventral tarafında ve% 70 etanol çözeltisi ile karın bölgesi ıslak. Bu noktada, Tablo 1&#39;e bakın ve bir not edin.Rektal kanama (anal orifis kan mevcut) veya her hayvan rektal prolapsus ny imzaladı. </li><li> Ventral orta hat kesi yaparak karın kesilirken standart diseksiyon makas kullanın. </li><li> Kolon bulun ve distal kolon serbest kolorektal marjı mümkün olduğu kadar yakın olarak kolon transect. </li><li> Dikkatli ve yavaş yavaş çevredeki mezenter ayrılmakta, tüm kolon çekin. </li><li> Kolon, kolon proksimal ucu serbest colonocecal marjı transect. Dışkı, dikkatle bir çift bükülmüş cımbız / forseps kullanarak dışarı sıkma ya da 3 ya da 5 ml şırınga bağlı bir sonda iğne kullanılarak, steril PBS ile kolon durulama tarafından kaldırılabilir. (Bkz. Bölüm 3.1) tüm kolon kullanarak, hasar değerlendirmek </li><li> Histolojik inceleme için doku örneklemesi ve diğer testleri örnek alan not ederek, 1.0 cm uzunluğunda kolon parçaları 0.5 cm kesim tarafından yapılabilir (yani proksimal, orta veya distal). </li><li> Doku örnekleritestleri, 1.5 ml Eppendorf tüpler ayrı ayrı yerleştirilir ve sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -70 ° C&#39;ye kadar saklanabilir için kullanılmak üzere </li></ol> 3. Kolit şiddetinin değerlendirilmesi <ol><li> Makroskopik ya da hastalık şiddeti skoru daha önce yayınlanmış bir skorlama sistemi (Tablo 1) kullanarak tarafsız bir gözlemci tarafından ölümcül değerlendirilir. Forseps bir çift kullanarak ve tutarlılığı belirlemek için dışkı bastırarak 9 Tabure tutarlılık değerlendirilebilir . Dışkı kan için bir puan belirlemek için, dışkı renginin not edin (örneğin dışkıya karşı açık kahverengi dışkı) ve daha ileri bir Hemoccult testi kullanılarak doğrulamak. Puanlama sistemi kullanarak, koşulların her biri için bir puan belirler. Her bir hayvan için son makroskopik skor her bir puan toplamına eşittir. </li><li> Kolit şiddeti histolojik hasarı değerlendirmek için, kolon tamponlu% 10 formalin küçük bir parçası (0.5 cm), bir doku kaset yeri ve batığın kesti. 5 hazırlayınmikron parafin uygun prosedürler kullanarak kesitler hematoksilen / eoxin (H &amp; E) ve leke bölümler gömülü. Colon parçaları proksimal, orta kolon veya kolon distal bölümünde alınabilir. </li><li> H &amp; E lekeli kolon doku bölümleri aşağıdaki önlemleri daha önce yayınlanmış bir sistem kullanarak bir kör gözlemci tarafından gol vardır: (tüm kript, 3 kaybı ile ciddi crypt bozulma, normal, 0), inflamatuvar hücre infiltrasyonu derece (Normal, 0 crypt mimari işaretli kas kalınlaşması mevcut, 3), goblet hücre kaybı (Yok, 0 - - mevcut, 1) ve kript absesi (yok, 0 - halen yoğun inflamatuar), kas kalınlaşması (crypt baz muskularis mukoza, 0 oturur 3 sızmak 1) 7 histolojik hasar skoru her bir puan toplamına eşittir. Bu crypt apseler insan UC aksine, bu modelin karakteristik değildir ve nadiren görülür belirtmek gerekir ki; mikroskobik ülserasyonlar da nadirdir. Eğer birden fazla kolon bölümleribenzer bölümler arasında lekeli, histolojik skor her alan için final skoru (distal kolonda histolojik skoru karşılık proksimal kolon yani histolojik skoru) belirlemek için kullanılmalıdır. </li></ol> 4. Deneyleri için reaktiflerin stok çözümleri hazırlayın <ol><li> Çözüm (K 2 HPO 4, çift bazlı potasyum fosfat 1 dH 2 O L 8.7 g) B çözeltisi ekleyerek 50 mM potasyum fosfat tampon solüsyonu hazırlayın (KH 2 PO 4, 1L tekbazlı potasyum fosfat 6.8 g dH 2 O) kadar 6.0 pH elde edilir. Kalan çözümler ileride kullanmak kadar buzdolabında (2-8 ° C) saklanabilir. </li><li> Potasyum Fosfat tamponu (50 mM, pH = 6.0) 1 L içine 5 gr HTAB ekleyerek hekzadesiltrimetilamonyum bromür (tablo) tampon hazırlayın. 2-8 çözülür ve saklamak için hafifçe ısı ° C kullanana kadar. Gerektiğinde, yeniden çözünmesi için ısı. </li><li> Protein analizi için doku homojenizasyon lizis tamponu hazırlayın1M Tris-hidroklorik asit (pH = 8.0), 5M sodyum klorür 6 mL ve 2 mL steril distile su Triton X-100 için 182 ml, 10 ml sözlerine ekledi. Triton X-100 oda sıcaklığında çok viskoz ve böylece, kullanımı hafifçe önceden ısınmış olmalıdır. Hazırlanan lizis tamponu, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 5. Deneyleri için örnek hazırlama <ol><li> MPO analizi için örnek hazırlanması. <ol><li> Örnekleri çıkarın -70 ° C ve buz koyun. 2mL Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüp (ya da bir homojenizatör ile kullanılabilecek herhangi bir tüp) / cımbız ve yerde boynu bükük forsepsle kullanarak görünür bir dışkı ya da yağ çıkardıktan sonra her numunenin ağırlığı kaydedin. Numuneler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Benzer kolon parçaları her bir biyolojik tekrarında (yani distal bölümleri tek veya proksimal bölümleri sadece) kullanılması gerektiğini dikkat etmek önemlidir. </li><li> Her örnek tüpü homojenizatör boncuk. </li><li> HTAB tampon uygun miktarda ekledoku ağırlığına göre ferin. Doku ağırlığı 25 mg daha az ise, 12.5mg/mL bir oranında tampon eklemek; doku ağırlığı 25-50 arasında ise, 25mg/mL bir oran ekleyin. Doku ağırlığı 50&#39;den büyükse, 50mg/mL bir oranında tampon ekleyin. </li><li> 4 dakika 30 Hz için bir doku homojenizatör ile homojenize. Doku tamamen homojenize değilse tekrarlayın. </li><li> Homojenizatör boncuk ve 6 dk (13400 xg, 4 ° C) santrifüj çözümü çıkarın. </li><li> Süpernatant toplayın ve sonuçta elde edilen pelet atın. Supernatent -70 ° C kullanana kadar saklanabilir. </li></ol></li><li> Sitokin analizi için örnek hazırlanması. <ol><li> Tekrar adımları 5.1.1. 5.1.2 için. </li><li> Proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) 50 ul hazırlanan lizis tamponu 10 ml ekleyin. </li><li> PIC ve ağırlığı ne olursa olsun her bir örnek için lizis tampon çözelti 1 ml ekleyin. </li><li> 30 Hz 5 dakika karıştırılır. Doku tamamen homojenize değilse tekrarlayın. </li><li> Homojenizatör boncuk ve santrifüj soluti çıkarın3300 x g. az 5 dakika </li><li> Süpernatant toplayın ve sonuçta elde edilen pelet atın. Süpernatant -70 ° C kullanana kadar saklanabilir. </li></ol></li></ol> 6. Inflamatuvar belirteçler Kantitasyonu <ol><li> MPO aktivitesi tahlil <ol><li> O dianisidine dihidroklorür dH 2 O, 90 ml ve 10 ml potasyum fosfat tamponu 16,7 mg birleştirerek o dianisidine dihidroklorür (o-dianisidine) çözeltisi hazırlayın . Bu çözüm, her tahlil için taze olarak hazırlanması gerekir. </li><li> 96 plaka, üç nüsha olarak doku Homojenat (bölüm 5.1 hazırlanan) 7 mcL ekleyin. </li><li> Seyreltilmiş H 2 O 2 (4% 30 H 2 O 2 96 dH 2 O mcL seyreltilmiş mcL) 50 mcL o dianisidine karışıma ekleyin. </li><li> 200 mcL kuyuların her H 2 O 2 içeren o-dianisidine karışımı eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Spectropho kullanarak 450 nm dalga boyunda absorbansı ölçülürtometer. 30 saniyelik aralıklarla az üç okuma çekin. </li><li> MPO aktivitesi hesaplayın. MPO aktivitesi MPO bir birim 1 mol H 2 O 2 oda sıcaklığında dakikada aşağılamak için gerekli olan miktar olarak tanımlanır MPO / mg doku birimleri (U) olarak ölçülür. MPO bir birim (U) = 1 mol H 2 O 2 split, ve H 2 O 2 1 mol 1.13 x 10 -2 nm / dk absorbans bir değişiklik verdiği göz önüne alındığında, her bir örnek MPO birimleri belirlenir. absorbans değişimi olarak [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Mg doku başına birimleri almak için, doku kullanın: tampon oranı. Örneğin, bir doku halinde: 50 mg / ml tampon oranı kullanılmıştır, 7 mcL Homojenat, 0.35 mg doku vardır. Bu nedenle, MPO birimleri bölmek, 0,35 mg doku başına birimleri almak için. Absorbans değerleri kullanarak bir örnek hesaplama (nm) (örnek, üç nüsha olarak eklenmiştir olduğunu varsayarak) aşağıda bulunmaktadır: </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td colspan="3"> Zaman 0 sec </td><td colspan="3"> Süresi 30 sn </td><td colspan="3"> Süresi 60 sn </td></tr><tr><td> A </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0,048 </td><td> 0,048 </td><td> 0,051 </td><td> 0,061 </td><td> 0,061 </td><td> 0,065 </td><td> 0,074 </td><td> 0,073 </td><td> 0,078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Ortalama Süre 0 sn = (0.048 + 0.048 + 0.051) / 3 = 0.049 nm </li><li> Süresi 30 sn ortalama = 0,0623 nm </li><li> Süresi 60 sn Ortalama = 0.075 nm </li><li> 0 ile 30 sn / mg doku (50 mg / ml doku varsayarak: tampon oranı) absorbans (ΔA) = [(0,0623-0,049) / (1.13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Absorbe içinde değişimance (ΔA) 30 - 60 sn / mg doku = 3,211 </li><li> * MPO aktivitesi (U / mg doku) ΔA = ortalama (0-30) ve ΔA (30-60) = 3,287 </li></ol><ol start="2"><li> ELISA ile pro-inflamatuar sitokinlerin Niceleme <ol><li> Sitokin (IL-1β, IL-6 ve TNF-α) düzeyleri ticari enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kiti (R &amp; D Systems Quantikine murin) kullanılarak belirlenir. </li><li> Her ELISA absorbans değerleri, her bir örnek için ilgili Bradford protein assay kullanarak normalize ve pg / mg protein birimleri cinsinden ifade edilir. </li></ol></li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Uygun DSS rejimi İdaresi farelerde akut kolit neden olacaktır. DSS tedavi süresince, DAI klinik hastalığın ilerleyişini değerlendirmek ve değerlendirmek için kullanılabilir. DSS ile tedavi edilen hayvanların ilk ağırlıklara göre belirgin kilo kaybı, gevşek dışkı ve dışkıkanama (Şekil 1). (Şekil 2 ve Tablo kolon fedakarlık ve sınav üzerine, kolit şiddeti makroskopik dışkı kıvamı gevşeme kolon uzunluğu, kolon kanaması, dışkı kanama, kısaltılması göre atılırsa, rektal kanama belirtileri ve sadece su ile tedavi kontrollere göre 1). H &amp; E ile boyandı kolon doku örnekleri kesitler DSS ile tedavi edilen iki nokta üst üste (Şekil 3) su ile tedavi edilen kontrol grubuna göre daha yüksek histolojik skorlar olacaktır. DSS ile tedavi edilen farelerde inflamasyon ölçüde karakterize etmek için, MPO aktivitesi homojenize kolon doku örnekleri değerlendirilebilir. DSS ile tedavi edilen iki nokta üst üste denetimleri (Şekil 4) kıyasla daha yüksek MPO aktivitesi olacak. Buna ek olarak, bu pro-inflamatuar sitokinlerin düzeylerinde artış (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Şekil 5) ile ilişkilidir. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Şekil 1 Erkek, C57BL / 6 fareler, 5 gün süreyle içme suyu% 5 DSS verildi . DAI puanları her bir hayvan için günlük olarak değerlendirildi ve her grup için günde (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ortalaması alınmıştır. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Şekil 2 C57BL / 6 farelerde 5 gün süreyle% 5 DSS içme suyu verildi. Kontrol farelerde DSS olmadan su aldı. Makroskopik hasar skoru / hastalık şiddeti skorları körü körüne gün 5 mesaj DSS-bağlı kolit olarak değerlendirildi. DSS alınan fareler izole edilen iki nokta üst üste yüksek makroskopik hasar skorları (rektal kanama, rektal prolapsus, ishal, kolonik kanama) daha fazla hastalık şiddeti (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) gösteren var. <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. C57BL / 6 fareler kolit ikna etmek için% 5 DSS çözüm içme suyu verildi. Kontrol fareler<html> DSS olmadan su aldı. (A) histolojik skorları körü körüne gün 5-DSS sonrası yönetim toplanan H &amp; E lekeli kolon doku bölümleri kullanılarak skorlandı. (B) (C) kontrol (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ile karşılaştırıldığında daha histolojik hasar (hücresel infiltrasyonu, goblet hücre tükenmesi, daha fazla bozulma / crypt mimarisine zarar) DSS-tedavi edilen örnekleri göstermektedir. (B) ve (C), yıldız (*) goblet hücre incelmesi ve crypt mimari bozulma alanı gösterir; sayı işareti (#) hücresel infiltrasyon gösterir. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Şekil 4. Tüm fareler gün 5 Posta idaresi, DSS ve kolon doku örnekleri üzerinde kurban MPO aktivitesi değerlendirmek için toplandı . DSS indüklediği kolit Önem kontroller (ortalama ± SEM, n = 4 fare / grup) ile karşılaştırıldığında yüksek düzeyde MPO aktivitesi ile ilişkilidir. _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5 yüksek MPO düzeyleri, DSS-kaynaklı kolit şiddeti yanı sıra aynı zamanda artmış IL-1β, IL-6, TNF-α gibi pro-inflamasyon sitokinlerin düzeyi (ortalama ± SEM, n = 4 fareler ile ilişkili / grup). <table border="1"><tbody><tr><td> Puan </td><td> Rektal kanama </td><td> Rektal prolapsus </td><td> Tabure Tutarlılık </td><td> Kan </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td><td> Normal </td><td> Normal </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kırmızı </td><td> Prolapsus belirtileri </td><td> Yumuşak </td><td> Kırmızı </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Koyu Kırmızı </td><td> Temizle prolapsusu </td><td> Çok Yumuşak </td><td> Koyu kırmızı </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Brüt Kanama </td><td> Kapsamlı prolapsusu </td><td> Ishal </td><td> Siyah </td></tr></tbody></tmümkün&gt; Tablo 1 Makroskopik / Hastalık Ciddiyet Skoru

<ol>
	<li>Sands, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+symptom+to+diagnosis:+clinical+distinctions+among+various+forms+of+intestinal+inflammation.">From symptom to diagnosis: clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 126, 1518-1532 (2004).</li><li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiopathogenesis+of+inflammatory+bowel+diseases.">Etiopathogenesis of inflammatory bowel diseases.</a> World J. Gastroenterol. 12, 4807-4812 (2006).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat. Protoc. 2, 541-546 (2007).</li><li>Axelsson, L. G., Landstrom, E., Goldschmidt, T. J., Gronberg, A., Bylund-Fellenius, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium+(DSS)+induced+experimental+colitis+in+immunodeficient+mice:+effects+in+CD4(+)-cell+depleted,+athymic+and+NK-cell+depleted+SCID+mice.">Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: effects in CD4(+)-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice.</a> Inflamm. Res. 45, 181-191 (1996).</li><li>Egger, B., Bajaj-Elliott, M., MacDonald, T. T., Inglin, R., Eysselein, V. E., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+acute+murine+dextran+sodium+sulphate+colitis:+cytokine+profile+and+dose+dependency.">Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis: cytokine profile and dose dependency.</a> Digestion. 62, 240-248 (2000).</li><li>Krawisz, J. E., Sharon, P., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+for+acute+intestinal+inflammation+based+on+myeloperoxidase+activity.+Assessment+of+inflammation+in+rat+and+hamster+models.">Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment of inflammation in rat and hamster models.</a> Gastroenterology. 87, 1344-1350 (1984).</li><li>Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathologic+study+of+dextran+sulfate+sodium+experimental+murine+colitis.">Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis.</a> Lab. Invest. 69, 238-249 (1993).</li><li>Smith, J. W., Castro, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+peroxidase+activity+in+gut+mucosa+to+inflammation.">Relation of peroxidase activity in gut mucosa to inflammation.</a> Am. J. Physiol. 234, R72-R79 (1978).</li><li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Kumar-Ondiveeran, H., Verdu, E. F., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vagus+nerve:+a+tonic+inhibitory+influence+associated+with+inflammatory+bowel+disease+in+a+murine+model.">The vagus nerve: a tonic inhibitory influence associated with inflammatory bowel disease in a murine model.</a> Gastroenterology. 131, 1122-1130 (2006).</li><li>Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., Nakaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice.">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98, 694-702 (1990).</li><li>Solomon, L., Mansor, S., Mallon, P., Donnelly, E., Hoper, M., Loughrey, M., Kirk, S., Gardiner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dextran+sulphate+sodium+(DSS)+model+of+colitis:+an+overview.">The dextran sulphate sodium (DSS) model of colitis: an overview.</a> Comparative Clinical Pathology. 19, 235-239 (2010).</li><li>Mähler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis.">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am. J. Physiol. 274, G544-G551 (1998).</li><li>Hans, W., Scholmerich, J., Gross, V., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+resident+intestinal+flora+in+acute+and+chronic+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+in+mice.">The role of the resident intestinal flora in acute and chronic dextran sulfate sodium-induced colitis in mice.</a> Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 12, 267-273 (2000).</li><li>Rath, H. C., Schultz, M., Freitag, R., Dieleman, L. A., Li, F., Linde, H., Schölmerich, J., Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+enteric+bacteria+induce+and+perpetuate+experimental+colitis+in+rats+and+mice.">Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice.</a> Infect. Immun. 69, 2277-2285 (2001).</li><li>Ghia, J. E., Li, N., Wang, H., Collins, M., Deng, Y., El-Sharkawy, R. T., Côté, F., Mallet, J., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+has+a+key+role+in+pathogenesis+of+experimental+colitis.">Serotonin has a key role in pathogenesis of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 137, 1649-1660 (2009).</li><li>Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hapten-induced+model+of+murine+inflammatory+bowel+disease:+mucosa+immune+responses+and+protection+by+tolerance.">Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance.</a> J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).</li><li>Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+occurs+in+severe+combined+immunodeficient+mice.">Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice.</a> Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

DSS kolit bağırsak inflamasyonu yaygın olarak kullanılan bir kimyasal indüklenen model. Bu modelde, fare, epitel hücreleri gut ve mukozal bariyer bütünlüğünü bozmaya zehirli olduğu düşünülmektedir DSS ile takviye içme suyu verilmiştir. DSS 10 İdaresi gevşek dışkı, dışkı kanama ile karakterize akut bir kolit neden olur , ve granülositler ile infiltrasyon 10 DSS yönetimi sırasında, kolit genellikle dışkı gaitada gizli kan testi ile tespit edilebilir önemli kilo kayb...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı: </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Eppendorf Safe-Lock Mikrosantrifüj Tüp (2mL) </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> BIOTEK EL808 Absorbans plaka okuyucu </td><td> BIOTEK </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Dekstran sülfat sodyum tuzu saflıkta (molekül ağırlığı 36,000-50,000 Da) </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 (yazılım) </td><td> BIOTEK </td><td> Sürüm 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Hekzadesiltrimetilamonyum bromür (HTAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Hidrojen peroksit, su içinde 30 ağırlıkça% çözüm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Mağaza 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest pl96-düz dipli yedi </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td><td> Tek kullanım için </td></tr><tr><td> o-Dianisidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Işığa karşı hassastır. Mağaza 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, dibazik </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, tekbazlı </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> -20 ° C&#39;de muhafaza </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Doku Lyser II Tungsten Karbür boncuk </td><td> QUIAGEN </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigating intestinal inflammation in dss-induced model of ibd

Inflamatuvar barsak hastalığı (İBH), bağırsak patolojileri, bir dizi olan en yaygın ülseratif kolit (ÜK) ve Crohn Hastalığı (CD) kapsar. UC ve CD, her iki kolonda bulunan, ishal, rektal kanama, karın ağrısı, kilo kaybı, benzer bir semptom profili oluşturmak 1. İBH patogenezinde bilinmemektedir rağmen, hem de içerir multifaktöryel bir hastalık olarak tanımlanmaktadır genetik ve çevresel bileşenleri 2 Kolonik inflamasyon IBH çeşitli özellikleri benzer çok sayıda ve değişken hayvan modelleri vardır. Kolit aralığı gerektiren kolit-tetikleyen kimyasallar, dekstran sülfat sodyum (DSS) gibi belirli konsantrasyonlarda bu yönetim için belirli türlerin duyarlı suşlar kendiliğinden ortaya çıkan bu hayvan modelleri. Kimyasal bağlı gut inflamasyon modelleri IBH en sık kullanılan ve en iyi tarif modelleri. Adminiiçme suyu DSS edilebilmektedir yönetim protokolüne bağlı olarak akut ya da kronik kolit üretir. DSS sergi kilo kaybı ve gevşek dışkı veya ishal belirtileri verilen 3 Hayvanlar, bazen rektal kanama bulgusu olan 4,5 İşte, biz yöntemleri açıklanmaktadır hangi kolit gelişimi ve ortaya çıkan inflamatuvar yanıt DSS takiben karakterize edilebilir. Bu yöntemler, iltihabın bir belirteç olarak kullanılabilir histolojik hematoksilen / eosin lekeli kolon bölümlerinin analizi, pro-inflamatuar sitokinlerin ölçümü ve belirlenmesi miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, 6 Hastalık durumu inflamatuvar yanıt ölçüde klinik semptomların varlığı veya mukozal doku histolojisi değişiklik tarafından tespit edilebilir. Kolon histolojik zarar crypt mimarisi, inflamatuar hücre infiltrasyonu, kas t kaybı gözeten bir skorlama sistemi kullanılarak değerlendirildi.hickening, goblet hücre tükenmesi ve kript absesi kantitatif 7, interlökin (IL)-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü (TNF)-α gibi akut inflamatuar özellikleri, pro-inflamatuar sitokinlerin düzeyleri kullanılarak tespit edilebilir geleneksel ELISA yöntemleri. Buna ek olarak, MPO aktivitesi kolorimetrik tahlil kullanarak ölçülebilir ve inflamasyonun bir göstergesi olarak kullanılan 8 Deneysel kolit, hastalık şiddeti genellikle, MPO aktivitesi artışı ve yüksek düzeyde pro-inflamatuar sitokinler ile ilişkilidir. Kolit şiddeti ve inflamasyon ile ilişkili hasar hematoksilen / eosin lekeli kolon doku kesitlerinde kullanarak bağırsak histopatolojik durumu değerlendirmek için ek olarak, dışkı kıvamı ve kanama inceleyerek tespit edilebilir. Kolon doku parçaları, MPO aktivitesi ve sitokin üretimi belirlemek için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, bu önlemler bağırsak inflamatuvar yanıtı değerlendirmek için kullanılır.deneysel kolit hayvan modelleri.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD at JoVE.com

Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Inflammatory bowel disease (IBD) encompasses a range of intestinal pathologies, the most common of which are ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease ...

investigating-intestinal-inflammation-in-dss-induced-model-of-ibd

Research

JoVE Journal

Biology

66.8K Görüntüleme.  McMaster University. Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

Video: Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Röportaj - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk incelenmesi

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Biyoloji

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

Ruminantlarda Bağırsak Döngüler kateterizasyonu

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Bağırsak kısmi tıkanıklık bir fare modeli

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high concentrations in specific and tertiary granules of neutrophils. This protocol details how MUB40&#160;conjugated directly to a fluorophore can be used to stain neutrophils in fixed/permeabilized tissues as well as how this can be used in live-cell imaging to assay for neutrophil activation and de-granulation. Neutrophil detection methods are limited to species-specific monoclonal antibodies, which are not always suitable for certain applications. MUB40 does not penetrate the cell membrane and is thus excluded from lactoferrin stored in non-activated/non-permeabilized neutrophils. MUB40 has the added benefit of recognizing lactoferrin from a broad host range, making it especially useful for comparing results in studies involving multiple research models, reducing the number of duplicate reagents, and simplifying protocols through single-step staining.

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Here, we present a protocol to detect the presence of neutrophils in fixed/permeabilized histology sections and assess the activation state of live purified neutrophils. In particular, the MUB40&#160;peptide binds lactoferrin present in neutrophil-specific and tertiary granules. Exposure of the granule contents through either permeabilization or neutrophil activation allows for the marking of neutrophils.

MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...