Wir danken Christian Landry für Hitze-Sonde Design, Daniel Babcock für die Entwicklung der Larven-Wärme-Sonde Assay, Sean Sweeney für die Annahme, die Hitze Platten-Assay, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegenfischer Aktien und Galko Labor Mitglieder für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH R01 NS069828 zu MJG und einem NIH-MARC-U-STAR Training Grant (T34GM079088 an der University of Houston-Downtown Scholars Akademie) für den Zugang von Minderheiten, die wissenschaftliche Laufbahn (AVG) unterstützt.

<ol>
	<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li><li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae.">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810 (2011).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field.">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li><li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptors--noxious+stimulus+detectors.">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis.">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li><li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction:+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila.">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li><li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock.">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Assays können die hier beschriebenen verwendet werden, um qualitativ und quantitativ beurteilen Larven verschiedener Genotypen für das Ansprechen auf schädliche thermische Reize werden. Ein wesentliches Merkmal der Wärmesonde Test ist, dass der Reiz nur an einem einzigen Ort gegeben ist. Dies führt vermutlich zu Brennen nur einen kleinen Teil der Klasse IV-Neuronen diejenigen des Segments der Sonde in Kontakt gebracht und vielleicht die in unmittelbar benachbarten Segmenten 11. Aufgrund der lokalen Stimulation, ahmt die Hitze-Sonde Assay das gemeinsame sinnliche Erfahrung zum Nachweis eines schädlichen Reiz, die einer bestimmten Körperregion-wie eine Hand in Kontakt bringen einer heißen Herdplatte lokalisiert ist. Ein Nachteil der Wärmesonde Test ist, dass es einige Benutzer-zu-Benutzer-Variabilität, die wahrscheinlich drei Faktoren zurückzuführen ist: i) der Druck, mit dem der Benutzer gilt die Sonde in die Larve, ii) die genaue Position der Sonde auf der Larven zu den darunter liegenden nozizeptiven Neuronen, und iii) die genaue ANGle, bei der die Sonde die Oberfläche berührt der Larve. Wir zuvor berichteten über eine quantitative Strategie zur Kategorisierung Larven in nicht-Respondern, langsam Responder und schnelle Ansprechen auf ihren Wegziehlatenz auf eine bestimmte Temperatur 1 umfassen. Wir berichten hier über Larven Reaktionsfähigkeit auf noch höhere Temperaturen. Interessanterweise finden wir, dass es eine Decke, um Larven thermische nozizeptive Antworten und dass diese Obergrenze liegt zwischen 52 und 54 ° C. Dies deutet darauf hin, dass Larven besitzen keine transient receptor potential (TRP) befähigten Kanals Gating bei Temperaturen höher als 52 ° C Alternativ könnte es nahe, dass die Nervenzellen oder Muskeln verwendet zu initiieren oder durchführen die motorische Reaktion beschädigt werden, bevor sie überhaupt in aversiven Rückzug funktionieren kann. Wir berichten auch über eine andere Analyse der Amplitude des Entzugserfolges-entweder die Anzahl der Rollen als Indikator für die &quot;Robustheit&quot; der Antwort. Naiv, einwürde erwarten, dass diese Parameter würden mit zunehmender Temperatur oder Zeit der Stimulation zu erhöhen. Überraschenderweise finden wir, dass dies nicht der Fall ist. Larven für eine längere Zeit bei einer Temperatur am unteren Ende des schädlichen Bereich (42 ° C) stimuliert für mehr Walzen und mehr Zeit für die Walzen als Larven bei höheren Temperaturen (48-52 ° C) sondiert. Dies deutet darauf hin, dass innerhalb des schädlichen Temperaturfenster es in erster Linie ist die Dauer der Exposition, die die Amplitude der Reaktion bestimmt. Da Larven zu hoch schädlichen Temperaturen ausgesetzt sind (48-52 ° C) im Durchschnitt sehr schnell reagieren, sie haben nicht so viele Rollen als Larven ausgesetzt zu einer weniger schädlichen Temperatur für eine längere Zeitspanne aufweisen. Die Analyse der Reaktion Amplitude berichtet hier fügt eine weitere quantitative Dimension, entlang der verschiedenen Genotypen oder Umwelt-Manipulationen verglichen werden können. Ein Hauptmerkmal der Hitze Platten-Assay ist, dass es eine globale Exposition gegenüber dem schädlichen beinhaltetWärme. Als solches ist es eher dem Tier sitzt in einem Heiz-Kessel als Berühren einer heißen Herdplatte. Es ist zwar nicht klar, wann die Larven einen global schädlichen Reiz in freier Wildbahn erleben kann, im Labor die Verhaltensreaktionen auf diese globale Exposition sind komplexer als diejenigen auf lokaler Stimulation beobachtet. Eine Stärke des Wärme-Platten-Assay, auch von anderen 3 notiert haben, ist, dass es wenig User-to-User-Variabilität hat seit Berühren der Larve ist nicht Bestandteil des Protokolls. Der einzige wesentliche Abweichung scheint bei der Definition, wenn jedes Verhalten beginnt, und dies kann bei wiederholter Betrachtung / Vertrautheit minimiert werden kann. Ein interessanter Unterschied zwischen den Tests ist die Temperaturen, bei denen die aversive Verhaltensweisen beginnen. Dies sind deutlich niedriger in der Hitze Platten-Assay als mit der Hitze-Sonde. Das vorläufige Verhalten von Larven mit der Hitze-Sonde (Kopf und Schwanz raise) kontaktiert ausgestellt kann eine des Kopfes Thrash bei ~ 27 ° C in der Hitze Plattform beobachtet korrelieren seinE-Assay. Es ist möglich, dass diese Antwort &quot;Unbehagen&quot; über &quot;Schmerz&quot; widerspiegelt. Wir haben keine der Auspeitschung, Beschlagnahme korrelieren, und auch bei hohen Lähmungen beobachtet werden (bis zu 48 ° C) Temperaturen in den Hitze-Sonde Assay und es kann sein, dass eine kritische Masse an sensorischen Neuronen feuern aus mehr als einer Region des Körpers ist erforderlich, um auf diese Verhaltensweisen zu bringen. Unterhalb des unteren Endes des nozizeptiven Schwelle mit der Hitze-Sonde zeigt, dass globale Stimulation kann es sich um Addition von neuronalen Reaktionen, die nicht ausreichen, um das Verhalten mit den lokalen auslösen beobachtet - Interessanterweise werden die Beschlagnahme und die Lähmung Verhaltensweisen bei Temperaturen (37 ° C ~ 34) beobachtet Anwendung der Wärme-Sonde. Dass diese Temperaturen werden tatsächlich als schädlich für die Larven wahrgenommen wird durch die Beobachtung, dass Larven, die die Lähmung Verhalten beginnen und anschließend dürfen auf Fly Lebensmittel nicht wieder in den meisten Fällen nicht (5C) überleben unterstützt. Weitere unterstützende das Argument, dass die Wärme plgegessen Assay wird Auslesen nocizeptiven Reaktionen ist die Tatsache, dass die Blockierung der synaptischen Übertragung in bekannter nozizeptiven sensorischen Neuronen verlangsamt die Reaktion meisten der beobachteten Verhalten (Abbildung 6). Die Beobachtung, dass es keine Erhöhung der Latenz für die höhere Temperatur-Verhalten legt nahe, dass Auspeitschen anderen sensorischen Neuronen, die nicht exprimieren, MD-Gal4 für dieses Verhalten kann erforderlich sein. In der Summe umfassen beide Assays Belichten eines einzelnen Larve zu einer schädlichen thermischen Reiz des definierten Temperatur - die heiße Spitze eines kleinen Metall-Sonde in der lokalen Assay und das Eintauchen in einen Tropfen Wasser erwärmt sich schnell in der globalen Assay. Verhaltensreaktionen von Drosophila-Larven von unterschiedlichen genetischen Hintergrund und / oder ausgesetzt wechselnden Umgebungsbedingungen (zum Beispiel plus oder minus Gewebeschädigung), können studiert und quantifiziert werden unter Verwendung dieser Assays. Letztlich werden die Ergebnisse aus diesen Tests helfen uns besser zu verstehen, genetische Netzwerke Controlling nociception bei Drosophila und anderen verwandten Arten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Thermische Sonde </td><td> Pro-Dev Technik </td><td> Auf Anfrage Custom-gebaut </td><td> Kontaktinformationen finden Sie auf Anfrage bereitgestellt werden </td></tr><tr><td> Trockenbad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 feste Heizblock und 1 Heizblock mit 16mm Bohrungen </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Farbkamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Eine äquivalente Kamera zu tun. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Teilenummer für MZ6 Zoom Körper (Optikträger) ist 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Einheit </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dual-Schwanenhals 23-Zoll-Lichtleitkabel </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Thermal Control Unit </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Einzelheiten können auf Anfrage geliefert werden </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000-Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Eine äquivalente Mikroskoptun wird. </td></tr><tr><td> Zange </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm Maschenweite </td><td> Genesee Scientific </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pinsel </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Vernetzer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Färbetrog </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml Becherglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 x 10 mm Petrischale aus Polystyrol </td><td> Falke </td><td> 351008 </td><td> Wir haben noch nicht getestet Alternative Gerichte. </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Thermoelement </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Stück Vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Scientific DenvilleInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

local and global methods of assessing thermal nociception in drosophila larvae

In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in Drosophila-Larven zu studieren. Ein Test umfasst die räumlich begrenzten (lokalen) Stimulation von Nozizeptoren thermische 1,2, während die zweite besteht aus einem Großhandel (globale) Aktivierung der meisten oder alle diese Neuronen 3. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken Visualisierung und Quantifizierung der Verhaltens-Funktionen von Drosophila nozizeptiven sensorischen Neuronen. Die Drosophila-Larve ist ein etabliertes Modellsystem, um die thermische Nozizeption, eine sensorische Reaktion auf potenziell schädlichen Temperaturen, die evolutionär über Artgrenzen 1,2 konserviert ist zu studieren. Die Vorteile von Drosophila für solche Studien sind die relative Einfachheit des Nervensystems und der Raffinesse der genetischen Techniken, die verwendet werden, um die molekulare Basis der zugrunde liegenden Biologie 4-6 in Drosophila sezieren kann, wie in allen Metazoen, die Response auf schädliche thermische Reize im Allgemeinen eine &quot;nozifensiven&quot; aversive Rückzug dem präsentierten Stimulus 7. Solche Impulse werden durch freie Nervenenden oder Nozizeptoren erkannt und die Amplitude des Organismus-Reaktion hängt von der Anzahl von Nozizeptoren Empfangen des schädlichen Reiz 8. Bei Drosophila sind es die Klasse IV dendritischen Verzweigungen sensorischen Neuronen, die schädliche thermische und mechanische Reize 9 erkennt zusätzlich zu ihrer Rolle als kürzlich entdeckten Photorezeptoren 10. Diese Neuronen, die sehr gut sind bei der Entwicklungsstufe studierte, über die Barriere epidermale Blatt verzweigen und Kontakte mit fast allen Epidermiszellen 11,12. Die einzelnes Axon jeder Klasse IV Neuron Projekte in den Bauchmark des zentralen Nervensystems 11, wo sie zu Neuronen zweiter Ordnung herstellen kann, dass Projekt an das Gehirn. Unter Ausgangsbedingungen, nozizeptiven sensorischen neurons wird erst ausgelöst, wenn ein relativ hoher Schwellenwert erreicht ist. Die beschriebenen Tests hier nehmen die Ermittler zu den Ausgangswerten Verhaltensreaktionen oder vermutlich die Sensibilisierung, die folgenden Gewebeschädigung erfolgt. Quantifizieren Jeder Test provoziert unterschiedliche, aber miteinander Bewegungsapparates Verhaltensreaktionen auf schädliche thermische Reize und ermöglicht die Forscher zu visualisieren und quantifizieren verschiedene Aspekte der thermischen Nozizeption in Drosophila-Larven. Die Tests können zu Larven der gewünschten Genotypen oder Larven unter verschiedenen Umweltbedingungen, die Nozizeption beeinflussen könnten erhoben angewendet werden. Da die thermische Nozizeption über Arten konserviert wird, werden die Erkenntnisse aus der genetischen Dissektion bei Drosophila gewonnenen wahrscheinlich informieren unser Verständnis der thermischen Nozizeption bei anderen Arten, einschließlich Wirbeltieren.

Watch this Scientific Journal Video about Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Ein Test umfasst die räumlich begrenzten (lokalen) Stimulation der thermischen Nozizeptoren<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Während die zweite besteht aus einem Großhandel (globale) Aktivierung der meisten oder alle diese Neuronen<sup&gt; 3</sup&gt;. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken Visualisierung und Quantifizierung der Verhaltens-Funktionen<em&gt; Drosophila</em&gt; Nozizeptiven sensorischen Neuronen.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

Human Biology

Sensory Systems

SCIENTISTS IN ACTION

15.6K Aufrufe.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in studieren Drosophila Larven. Ein Test umfasst die räumlich begrenzten (lokalen) Stimulation der thermischen Nozizeptoren 1,2, Während die zweite besteht aus einem Großhandel (globale) Aktivierung der meisten oder alle diese Neuronen 3. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken Visualisierung und Quantifizierung der Verhaltens-Funktionen Drosophila