Wir danken Sarah Wu und Camille Graham für die kritische Lektüre des Manuskripts frühen Phasen des kalten Sondentest, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Aktien und Galko lab Mitglieder zu entwickeln. Diese Arbeit wurde durch die NIH NRSA (NIH F31NS083306) zu HNT, und von NIH R01NS069828, R21NS087360 und University of Texas MD Anderson Clark Stipendium in der Grundlagenforschung zu MJG unterstützt.

1. Herstellung von Larvae <ol><li> Heben Sie Aktien oder genetische Kreuzungen in einem 25 ° C Inkubator. <ol><li> Wenn ein Kreuz Kultivierung verwendet 20-25 jungfräuliche Weibchen und Männchen 15-20 pro Fläschchen regelmäßige cornmeal Fliegen Medien enthält. Lassen Sie Weibchen Eier legen für etwa 48 Stunden, bevor sie in ein neues Fläschchen von Lebensmitteln zu übertragen. </li></ol></li><li> 4-5 Tage nach der Eierlegens, sammeln 3. Larvenstadium des gewünschten Genotyps durch vorsichtiges einen Strom von Wasser in die breiartige Nahrung und Larven, spritz- und den Inhalt in eine mittlere, saubere Petrischale gießen (60 mm x 15 mm). </li><li> Als nächstes sanft Larven nach Größe mit einer Pinzette oder einem Pinsel sortiert größeren „wandernden 3. Instar“ oder kleine sickly Larven auszuschließen getestet vom werden. Discard Larven keine unerwünschten genetischen Markern oder Ausgleicher enthält. </li><li> Haben Sie ein Kerl Labor Mitglied Etikett Gerichte oder Container, in denen sortiert Larven platziert werden, so dass der Experimentator „blind“ auf die Ex sein kannperimental Zustand oder Genotyp der Larven, wenn anwendbar. Der Experimentator kann entschlüsselten Etikett gesammelte Daten nach dem Experiment anwenden einen Schlüssel von einem Labor-Mitglied generiert. </li><li> Verwendung einen Spatel, überträgt einen Dime große Menge frischer Lebensmittel in ein (35 mm x 10 mm oder 60 mm x 15 mm) sauber, markierten Petrischalen gefüllt Hälfte mit Wasser von Raumtemperatur. </li><li> Sanft bewegen, um die Nahrung auf die sortierte Larven (Hungern oder Austrocknung zu verhindern, wenn der Test über 20 min zu nehmen erwartet wird) mit einer Pinzette oder einem Pinsel. </li></ol> 2. Kalt Probe Assay <ol><li> Schalten Sie den kalten Sondeneinheit ermöglicht einige min auf die gewünschte Temperatur zu kühlen. Wenn auf niedrigere Temperaturen einstellen, Kondenswasser entlang der Sonde wahrscheinlich bilden. </li><li> Wischen Sie überschüssige Feuchtigkeit mit einem Labortuch vor dem Auftragen auf die Larve. Wenn er nicht in der sofortigen Einsatz, isolierende Stelle Kappe auf Sonde sowohl zu isolieren und die Spitze sauber zu halten und Schäden zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine Mitte 3. Larvenstadium auf ein dünnes Stück dunkle beweglichen Vinyl (typischerweise mit einem kleinen Stück von einem Notebook Bindemittel geschnitten) unter einem Hellfeld - Mikroskop. Die schwarzen Vinyl AIDS in Kontrastdarstellung und in die Larve Bewegen ohne es zu berühren sie mit der Sonde richtig auszurichten. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop (siehe Tabelle of Materials) und die Lichteinheit (siehe Tabelle of Materials) bis mittlere Helligkeit (50-75% max Helligkeit) Kontrast zu schaffen und zu verhindern , die Larve vor dem Austrocknen zu schnell aus. </li><li> Entsorgen Sie alle Larven, die nicht zuerst normale peristaltische Fortbewegung aufweisen, wie sie die Ergebnisse durcheinander bringen könnte. Die Larve sollte feucht sein, aus der Petrischale von Wasser sonst die Larve zum Hemmen Vinyl normale Fortbewegung haftet. Das Wasser sollte nicht um die Larve Pfütze. </li><li> Voraus, um die Sonde mit der Hand in Richtung der Larve in einem 90º Winkel zu der anteroposterioren Körperachse, die mit der Vinyl Larve in cor zu bewegenrect Position (siehe 1A). </li><li> Orient die Spitze der Sonde zu legen, leicht über die Mitte der dorsalen Oberfläche der Larve mit der Sonde bei etwa einem 45 ° Winkel zu dem Mikroskoptisch. </li><li> Bei Antastelement, ein Labor-Timer starten. Genügend Druck nach unten zu leicht, die Oberfläche der Larvencuticula einrücken, während noch Vorwärts- oder Rückwärtsbewegung ermöglicht wird. </li><li> Halten Sie die Sonde in Platz für bis zu 10 s oder bis eine Kalt evozierte Verhaltensreaktion beobachtet wird - je nachdem, was zuerst eintritt. Dann die Sonde entfernen. </li><li> Notieren Sie sich die beobachteten Verhaltensreaktion und die Antwort-Latenz. Larven, die nicht innerhalb von 10 s reagieren werden „Non-Responder“ betrachtet. Latenz kann auch für Responder aufgezeichnet und verwendet, um Änderungen in Reaktion Robustheit / Amplitude zu messen. </li><li> Entsorgen Larve und bereiten die nächste. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,11, bis die gewünschte Anzahl von Testlarven erreicht ist (drei Sätze von n = 20-40 Larven wurden used hier). </li></ol>

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Eine US-Patentanmeldung (CL) fehlt noch auf der Gestaltung der kalten Sonde. Weitere Informationen über Einzelheiten der kalten Sonde Teilenummern und Konstruktion, sowie zusätzliche Beratung über Werkzeugkonstruktion werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.

Der Test hier beschrieben ist, kann verwendet werden, um qualitativ und quantitativ Nozizeption oder nozizeptive Sensibilisierung in Larven von verschiedenen genetischen Hintergründen, Umwelteinflüssen zu bewerten und / oder Schäden induzierten Bedingungen. Da dieser Test für Focal Anwendung eines Kältereizes ermöglicht, mit diesem Werkzeug kann man die Funktion einer Untergruppe von peripheren sensorischen Neuronen spezifisch an kalten Temperaturen bei der Reaktion abzuschätzen. Interessanterweise scheinen diese...

Drosophila hat sich als sehr nützlich für die Identifizierung von neuen Genen konserviert und neuronaler Schaltkreise sein , das komplexe Verhalten zugrunde liegen. Flies liefern eine hoch entwickelte genetische Toolkit und ein vereinfachtes Nervensystems , die 1, für die präzise genetische Manipulation und neuronaler erlauben 2, 3, 4 , um die zellulären und molekularen Grundlagen der Nozizeption 5, 6, 7 zu sezieren. Larven sind besonders nützlich für diese Analysen, da der Verhaltensassays für sanfte Berührung 8, 9, 10, schädliche Wärme 11, 12, 13 und die mechanische Empfindung von schädlichen Reizen 4, </sup&gt; 11 haben bereits festgestellt worden ist , und die transparente Larvencuticula ermöglicht lebenden oder fixierten Abbildung der Epidermis und der darunter liegenden sensorischen Neuronen. Vor kurzem wurde ein Test für schädliche Kälte auch 7 entwickelt, die wir hier näher beschreiben. Unter Verwendung eine feine, konisch bestückte kalte Sonde zeigen wir , dass Drosophila - Larven zeigen eine Reihe von Kalt spezifischen reaktiven Verhaltensweisen, die sich von Verhaltensweisen während der normalen Fortbewegung, folgenden sanfte Berührung beobachtet oder nach hartem mechanischem oder hohen Temperaturen Stimuli 7, 8, 11 . Die kalt spezifischen Verhaltensweisen beinhalten eine robuste Ganzkörper-Kontraktion (CT), ein 45-90º Erhöhung der posterioren Segmente (PR) und einer gleichzeitigen Erhöhung der vorderen und hinteren Segmente in einer U-Form (US). Die Prävalenz dieser Verhaltensweisen steigt mit abnehmender Temperatur, aber jedes Peaks bei sleicht unterschiedliche kalte Temperaturen. Neuere Arbeiten legen nahe , dass CT - Antworten von verschiedenen peripheren sensorischen Neuronen als die vermittelt werden , die 7 bis schädlicher Hitze oder groben mechanischen Reiz reagieren. Ähnlich wie wirbel Nozizeptoren, Drosophila multiple dendritische (md) periphere sensorische Neuronen haben komplexe dendritische Strukturen , die 1 über die Epidermis verzweigen. md Neuronen ist in jedem larvalen Körpersegment, ihre Axone zu der Bauchmark 14 vorsteht. md sensorische Neuronen sind in vier verschiedene Klassen eingeteilt (I-IV) auf dendritische Morphologie basierten und sensorische Funktionen haben variierende 4, 9, 10, 15, 16, 17. Während Klasse IV Neuronen sind für die Larven seitliche Wankbewegungen Antworten erforderlichgegenüber hohe Temperaturen oder aggressiven mechanischen Reiz 4, Klasse III - Neuronen sind für die sanfte Berührung Antworten 9, 10 erforderlich , und werden nicht nur durch Kalt aktiviert, sind jedoch für die Kalt evozierten Verhaltensreaktionen 7 ebenfalls erforderlich. Beiden Klassen III und Klasse IV Neuronen verwenden diskrete transient receptor potential (TRP) Kanäle Verhaltensreaktionen auf schädliches 7, 11, 18 und nicht-schädlichen Reiz 9, 10, 17, 19 zu erleichtern. Ferner ist Larven Nozizeption nach einer Verletzung sensibilisiert, auf zellulärer 20 und Verhaltensstufen 12, 21. Der Test hier beschrieben ermöglicht die quantification entweder normal oder möglicherweise veränderte Verhaltensreaktionen auf kalte Temperaturen im Bereich von schädlicher Kälte (≤ 10 ° C), unschädliche kühlen (11-17 ºC), auf Umgebungstemperatur (18-22 ºC). Die kalten Temperaturen in diesem Test verwendet werden , sind fähig Klasse III sensorische Neuronen direkt Aktivierung Hervorrufen robust, reproduzierbar Calciumerhöhungen und kalt evozierten Verhaltensreaktionen, die qualitativ und quantitativ sein können , 7 analysiert. Dieser Test kann auf unterschiedliche Umweltbedingungen (veränderte Ernährung, Verletzungen, pharmakologische Wirkstoffe) sowohl genetische als auch Umweltfaktoren zu bestimmen, ausgesetzt von praktisch jeden Genotyp sowie den Larven Larven angewandt werden, die kalt Nozizeption, nozizeptive Sensibilisierung oder nozizeptiven Plastizität auswirken. Da thermosensation ist allgegenwärtig in vielen Arten, stellt dieser Test ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Nozizeption und kann neue Genziele oder neuronale Interaktionen aufzudecken, die verbessernunser Verständnis von Wirbeln Nozizeption. Die angefertigten kalte Sonde (siehe kalte Sonde, Table of Materials) verwendet eine geschlossene Regelkreis Temperatur Peltier - Vorrichtung gesteuert wird , die die Aluminiumschaft und konische Spitze durch Wärmeleitung kühlt. Ein Thermistor ist im Inneren der Aluminium-konischen Spitze eingebetteten berichtet die Echtzeit-Temperatur auf die Steuereinheit. Ein Kühlkörper und Lüfter sind mit der thermoelektrischen Modul befestigt , um den Peltier - Effekt der Wärmelast (Qc) so den gewünschten Temperaturbereich von (22-0 ° C) zu regulieren (siehe Thermal Control Unit, Table of Materials) erreicht werden. Der gesundheitsschädliche Kältereiz des kalten Sondenspitze mit der Hand auf die dorsalen Mittellinie aufgebracht wird, zu segmentieren (n) im gleichen Abstand von vorderen und hinteren Enden der Larve (ungefähr Segment A4, siehe 1A). Als Reaktion auf Kältereize, Larven erzeugen im allgemeinen eine von drei Kalt evozierte Verhaltensweisen innerhalb von 10 s Cutoff: ein GanzkörperKontraktion (CT), eine Erhöhung von 45-90º anterioren und posterioren Segmente in einer U-Form (US) oder eine Erhöhung der posterioren Segmente (PR) (im beschriebenen Ergebnisse). Keines dieser Verhaltensweisen während des normalen peristaltische Fortbewegung oder Nahrungssuchverhalten durchgeführt. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von sanfter Berührung Reaktionen und die aversiven Roll Reaktion auf hohe Temperaturen oder schädliche mechanische Reize.

<table><tbody><tr><td>Cold Probe</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Custom-built on demand</td><td>Part numbers and construction details can be provided on request</td></tr><tr><td>Thermal Control Unit</td><td>TE Technology</td><td>Custom Built enclosure</td><td>Part numbers and construction details can be provided on request</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 microscope</td><td>Zeiss</td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner Industries.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches)</td><td></td><td></td><td>Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe</td></tr><tr><td>Fisherbrand Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Used to move food</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture</td></tr></tbody></table>

novel assay for cold nociception in drosophila larvae

Wie Organismen erkennen und darauf reagieren auf schädliche Temperaturen ist noch wenig verstanden. Ferner sind die Mechanismen Sensibilisierung der sensorischen Maschinen zugrunde liegen, wie bei Patienten periphere Neuropathie oder Verletzung induzierte Sensibilisierung erfahren, nicht gut charakterisiert. Genetisch tractable Drosophila - Modell wird verwendet, um die Zellen und Gene zu untersuchen , die für schädliche Brunsterkennung, welches mehrere konservierte Gene von Interesse ergeben. Es ist wenig bekannt, aber über die Zellen und Rezeptoren wichtig für schädliche Kälte Erkundung. Obwohl nicht Drosophila nicht längere überleben Exposition gegenüber kalten Temperaturen (≤10 ° C), und vermeidet kühlen, lieber wärmere Temperaturen in Verhaltenspräferenztests, wie sie fühlen und möglicherweise schädliche Kältereize vermeiden wurde erst vor kurzem untersucht worden. Hier beschreiben wir, und charakterisieren, die erste schädliche Kälte (≤10 ºC) Verhaltenstest inDrosophila. Mit diesem Tool und Test zeigen wir einen Ermittler, wie man qualitativ und quantitativ kalt nocizeptives Verhalten beurteilen. Dies kann unter normalen / gesunden Kulturbedingungen durchgeführt werden, oder vermutlich im Zusammenhang mit der Krankheit, Verletzung oder Sensibilisierung. Ferner kann dieser Assay für die Larven gewünschten Genotypen ausgewählt aufgebracht werden, die thermosensation auswirken könnten, Schmerzen oder nozizeptive Sensibilisierung. Da Schmerz ist ein hoch konservierter Prozess, unter Verwendung dieser Tests zum weiteren thermischen Nozizeption studieren wird wahrscheinlich wichtiges Verständnis der Schmerzprozesse in anderer Spezies aufzuzulesen, einschließlich Wirbeltiere.

Drosophila - Larven bewegen sich mit einer peristaltischen Bewegung , die gelegentliche Pausen umfasst, Kopf dreht, und Änderungen in der Richtung 22. Als Reaktion auf die fokale Anwendung eines schädlichen Kältereiz jedoch Larven zeigen eine Reihe von einzigartigen Verhalten, im Gegensatz zu den aversiven Seitenrolle schädliche Hitze und mechanische Reize. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von Antworten auf sanfte Berührung <sup class="xr...

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Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

novel-assay-for-cold-nociception-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

7.7K Aufrufe.  UT MD Anderson Cancer Center.  Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen. 

Serie: Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Immunologie und Infektion

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Verhalten

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which enables them to seek out their preferred thermal landscape. To define the temperature preferences of larvae over a defined linear range, we developed an assay using a temperature gradient. To establish a single-directional gradient, two aluminum blocks are connected to independent water baths, each of which controls the temperature of individual blocks. The two blocks set the lower and upper limits of the gradient. The temperature gradient is established by placing an agarose-coated aluminum plate over the two water-controlled blocks so that the plate spans the distance between them. The ends of the aluminum plate that is set on the top of the water blocks defines the minimum and maximum temperatures, and the regions in-between the two blocks form a linear temperature gradient. The gradient assay can be applied to&#160;larvae of different ages and can be used to identify mutants that exhibit phenotypes, such as those with mutations affecting genes encoding TRP channels and opsins, which are required for temperature discrimination.

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Here, we present a protocol to determine the preferred environmental temperature of Drosophila larvae using a continuous thermal gradient.

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study introduces easy-to-implement setups for applying optogenetic methods in Drosophila melanogaster. Two optogenetic tools, CsChrimson, a red-light-activated cation channel, and GtACR2, a blue-light-activated anion channel, were employed in four experimental approaches. Three of these approaches involve single-fly experiments: (1) a blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay targeting temperature-sensitive heating cells, (2) a red-light optogenetic positional preference assay activating bitter sensing neurons, and (3) a proboscis extension response assay activating the sweet-sensing neurons. The fourth approach (4) is a fly maze setup to assess avoidance behaviors using multiple flies. The ability to manipulate neural activity temporally and spatially offers powerful insights into sensory processing and decision-making, underscoring the potential of optogenetics to advance our knowledge of neural function. These methods provide an accessible and robust framework for future research in neuroscience to enhance the understanding of specific neural pathways and their behavioral outcomes.

This paper presents methods for optogenetic manipulation in Drosophila melanogaster, utilizing CsChrimson and GtACR2 to activate and silence specific neurons. Four experiments are described to utilize optogenetics to explore thermotactic and gustatory behaviors, providing insights into the underlying neural mechanisms governing these processes.

Verhaltensassays zur optogenetischen Manipulation neuronaler Schaltkreise in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

Local Heat Probe Assay: A Method to Assess Nociception of High Temperatures in Drosophila Larvae

Source: Chattopadhyay, A., et al. <a href="https://www.jove.com/video/3837/" target="_blank">Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae have dedicated sensory neurons&#8211;nociceptors&#8211;whose response to potentially harmful thermal stimuli triggers aversive&#8211;or so-called &#34;nocifensive&#34;&#8211;behaviors in the animal. This video describes a method to assess thermal nociception by recording larval behavior in response to local application of a heat probe onto the cuticle. This method is, therefore, called the local heat probe assay.

Lokaler Wärmesonden-Assay: Eine Methode zur Beurteilung der Nozizeption hoher Temperaturen bei Drosophila-Larven

Source: Chattopadhyay, A., et al. Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae ...

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in

Zusammenfassung

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