Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Bewertung der NF-kappa-B- und AP-1-Aktivität in Reportermakrophagen, die auf adsorbierten Proteinschichten kultiviert werden, und den Beitrag von Zellsignalpfaden, wie tollähnlichen Rezeptoren, zu dieser Reaktion. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit, die es ermöglicht, Zellkulturübersprecher schnell für NF-kappa-B und AP-1-Aktivität mit einem einfachen enzymatischen Assay zu analysieren. Beginnen Sie mit der Auflösung von PMMA in Chloroform bei einer Endkonzentration von 20 Milligramm pro Milliliter in einer 20-Milliliter-Glasszintillationsdurchstechflasche in einer Dunstabzugshaube.
Legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Durchstechflasche und rühren Sie die Mischung mindestens zwei Stunden lang. Wenn alle Feststoffe gelöst sind, übertragen Sie 400 Mikroliter der PMMA-Lösung auf die Mitte jedes Borosilikatglasmikroskopschlittens pro geplanter Bedingung auf einem Spincoater und drehen Sie das PMMA für zwei Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute auf das Dia. Dann die spin-beschichteten Dias in einer 70%Ethanol-gesprühten Reinigungsbox aufbewahren.
Als nächstes, in einem biologischen Sicherheitsschrank, verwenden Sie sterile Zangen und aseptische Technik, um achtkammerige Klebebrunnen an den PMMA-beschichteten Dias zu befestigen, wobei Sie fest auf die Oberseite jedes klebrigen Brunnens drücken, um sicherzustellen, dass sie fest befestigt sind. Achten Sie darauf, die klebrigen Brunnen mit den Rändern des Mikroskopschlittens auszurichten, damit alle Brunnen am Schlitten befestigt werden und nicht auslaufen. Inkubieren Sie die klebrigen, gut befestigten Rutschen bei 37 Grad Celsius über Nacht, um die Dichtungen zu sichern.
Dann fügen Sie 200 Mikroliter Zellkultur-Grade Endotoxin-freies Wasser zu jedem Brunnen für eine 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, um die Dichtungen am nächsten Morgen zu testen. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie das Wasser, achten Sie darauf, die PMMA-Beschichtung nicht zu stören. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit 300 Mikroliter frischem Endotoxin-freiem Wasser für eine Stunde pro Wäsche gefolgt von einer 12-Stunden-Waschzeit und einer 24-Stunden-Wäsche vor dem Gebrauch, um das verbleibende Lösungsmittel zu entfernen.
Dann UV sterilisieren die Dias für 30 Minuten. Um 3T3-Zelllysate zu erhalten, wenn die 3T3-Zellkulturen 70% Konfluss in T150-Kulturkolben erreichen, waschen Sie jede Kultur mit fünf MilliliterPBS und behandeln Sie die Zellen mit fünf Millilitern tierischen Ursprungsfrei, rekombinanten Zelldissoziationsenzyms bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Am Ende der Inkubation, neigen Sie jeden Kolben vorsichtig hin und her ein paar Mal, um die Zellen zu lösen, bevor Sie das Enzym mit fünf Milliliter PBS pro Kultur neutralisieren.
Bündeln Sie die dissoziierten Zellen in einem einzigen 50-Milliliter-Zentrifugenrohr, und verwenden Sie eine Pipette, um zellverstopfte Zellen zu aufzubrechen. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen bei einem Mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter Konzentration in frischen PBS.
Dann frieren Sie die Zellen in einem minus 80-Grad-Gefrierschrank für mindestens zwei Stunden ein, bis die Probe vollständig eingefroren ist, bevor die gefrorene Zelllösung in ein 37-Grad-Celsius-Wasserbad gelegt wird, bis sie vollständig aufgetaut ist. Um die Auswirkungen einer adsorbierten Proteinschicht auf die toll-like Rezeptor-vermittelte NF-kappa-B/AP-1-Aktivität zu bewerten, nachdem Reportermakrophagen in einem entsprechend großen Kolben zu 70 % Zusammenfluss angewachsen sind, lösen Sie die Zellen mit einer geeigneten enzymatischen Dissoziationslösung, wie gezeigt. Setzen Sie die Zellen bei 7,3 mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter Konzentration im Assaymedium aus und aliquotieren die Zellen gleichmäßig zwischen drei Röhren.
Behandeln Sie die erste Zellröhre mit einem Mikrogramm pro Milliliter TLR4-Inhibitor 60 Minuten bei Raumtemperatur, behandeln Sie die zweite Tube mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Anti-TLR2-Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur und lassen Sie das dritte Rohr bei Raumtemperatur ohne Behandlung. Während die Zellen inkubieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lysat und 10% fetales Rinderserum zu drei klebrigen Brunnen pro Zustand hinzu. Lassen Sie die Proteine für die entsprechende Versuchszeit bei 37 Grad Celsius adsorbieren, bevor Sie die Proteinlösungen mit einer neuen Pasteur-Pipette für jeden Brunnen ansaugen und die klebrigen Brunnenoberflächen dreimal mit 250 MikroliterPBS pro Brunnen für fünf Minuten pro Waschgang waschen.
Am Ende der Reporter-Makrophagen-Behandlung, fügen Sie 200 Mikroliter Zelllösung zu jedem Brunnen. Fügen Sie Pam3CSK4 einer Endkonzentration von 150 Nanogramm pro Milliliter zu zwei Brunnen als TLR2-Positivkontrolle hinzu, wie im Schaltplan dargestellt. Für eine TLR4-Positivkontrolle fügen Sie Lipopolysaccharid zu einer Endkonzentration von 1,5 Mikrogramm pro Milliliter in zwei Brunnen hinzu.
Nach 20 Stunden bei 37 Grad Celsius, Platte 20 Mikroliter Überstand aus jedem Brunnen in doppelt erplizieren in einer 96-Well-Platte, darunter drei Brunnen mit 20 Mikroliter Assay-Medium pro sowie die Hintergrundkontrolle. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter SEAP Reporter-Assay-Reagenz zu jedem Brunnen hinzu und bedecken Sie die Platte mit einer Klebedichtung für eine 2 1/2-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Den Rest des Überstandes auf ein 1,5-Milliliter-Rohr pro klebrigen Brunnen übertragen und den Schutt durch Zentrifugation sedimentieren.
Übertragen Sie dann die Überdrinen in neue 1,5-Milliliter-Rohre für eine Speicherung von minus 80 Grad Celsius für die nachgeschaltete proinflammatorische Zytokinanalyse per ELISA. Am Ende der Inkubation entfernen Sie die Klebedichtung von der Platte und lesen Sie die Absorption auf einem Plattenleser bei 635 Nanometern. EinweichenpmMA-beschichtete Mikroskop-Dias in 70%Ethanol für eine Stunde entfernt die PMMA-Beschichtung, während weder 70%Ethanol noch UV-Sterilisation den Wasserkontaktwinkel von fPTFE-beschichteten Abdeckungen beeinflusst.
Die Western-Blot-Analyse von 3T3-Lysaten zeigt das Vorhandensein von HMGB1 und Hitzeschockprotein 60, zwei gut dokumentierten schadensassoziierten molekularen Mustern. Die Adsorption von TLR-Liganden aus dem Lysat auf die Polymeroberflächen kann durch die Kultivierung von Reportermakrophagen für 20 Stunden auf den proteinadsorbten Polymeroberflächen und dann indirekt die NF-kappa-B/AP-1-Aktivität mittels eines enzymatischen Assays bestätigt werden. Diese Aktivität wird nach der Hemmung der TLR2- oder TLR4-Signalisierung reduziert.
Darüber hinaus haben Reportermakrophagen die NF-kappa-B/AP-1-Aktivität als Reaktion auf adsorbiertes Lysat im Vergleich zu adsorbiertem FBS oder Plasma und ohne voradsorbiertes Protein signifikant erhöht. Darüber hinaus induzieren kleine Mengen lysiertes Lysat in Serum signifikant erhöhte NF-kappa-B/AP-1-Antworten im Vergleich zu Serum allein, wobei die niedrigste effektive Verdünnung von der Polymeroberfläche abhängt. Um eine Endotoxinkontamination der beschichteten Oberflächen zu vermeiden, arbeiten Sie in sauberen Bereichen, bedecken Sie die Oberflächen, wenn sie nicht verwendet werden, und verwenden Sie Zellkultur-Wasser und Puffer für Spülungen.
Nach diesem Verfahren können Immunoassays an den verbleibenden Überstandmitteln durchgeführt werden, um die Proteinsekretion zu bewerten, und Makrophagen können durch Durchflusszytometrie und qPCR-Genexpressionsanalyse analysiert werden.
