Pseudomonas aeruginosa ist ein BSL-2-Level-Erreger. Denken Sie daran, alle Sicherheitspraktiken auf BSL-2-Ebene zu befolgen, wenn Sie mit diesem Organismus umgehen. Hier zeigen wir primäre Zellisolation, In-vitro-Phagozytose und phagozytische Signalweganalyse sowie in vivo Phagozytose und bakterielle Clearance-Bewertung bei Mäusen.
Erfolgreiche intratracheale Lieferung erfordert Praxis zu meistern. Stellen Sie sicher, dass der Microsprayer richtig geladen ist, die Nadel zwischen den beiden Stimmfalten liegt und die Kolbengeschwindigkeit richtig gesteuert wird. Beginnen Sie, indem Sie die Maus in der Rückenlage mit den Gliedmaßen auf einer mit Papiertüchern bedeckten Sezierplatte sichern und eine Schnur unter den Vorderzähnen einhaken, um den Kopf so zurückzuziehen, dass die Luftröhre gerade und eben positioniert ist.
Desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanol und verwenden Sie regelmäßige Zangen, um die Haut an der Mittellinie des Körpers hochzuziehen. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut vom Bauch bis zur Oberseite des Halses zu schneiden. Verwenden Sie das stumpfe Ende der Standard-Chirurgischen Schere, um den Halsmuskel und das Bindegewebe sorgfältig zu sezieren.
Öffnen Sie die Bauchwand unter dem Brustkorb. Schneiden Sie das Zwerchfell und schneiden Sie den unteren Teil des Brustkorbs weg, um die Lunge teilweise freizulegen. Verwenden Sie eine Federschere, um die Luftröhre freizulegen, und verwenden Sie die Zange, um einen Knorpelring zu greifen.
Verwenden Sie Mikroscheren, um sorgfältig einen etwa 1,5-Millimeter-Schnitt auf der ventralen Fläche der Luftröhre zu machen. Eine kurze Länge des Nahtgewindes vorsichtig unter die Luftröhre spannen und eine 18 Gauge Kanüle in die Luftröhre einlegen. Wenn die Kanüle an Ort und Stelle ist, spülen Sie die Lunge dreimal mit einem Milliliter frischer PBS pro Wäsche, und ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in die Spritze zurück, bevor Sie sie dreimal hintereinander wieder in die Lunge einfließen lassen.
Nach jeder Spülung die gesammelte Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit oder BALF in ein 15-Milliliter-Konusrohr zur Zentrifugierung der gesamten geernteten Flüssigkeit übertragen. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS für eine zweite Zentrifugation wieder aus und setzen Sie die gewaschenen Alveolarmakrophagen in zwei Milliliter von Dulbeccos Modified Eagles Medium oder DMEM ab, ergänzt mit 10%nicht-hitzeaktiviertem fetalaktiviertem Rinderserum. Dann übertragen Sie die primären Alveolar-Makrophagen auf eine Glasboden-Petrischale für ihre zweitägige Kultur bei 37 Grad Celsius in einem Zellbrutkasten.
Nach 48 Stunden die Kultur mit einem Milliliter PBS waschen, bevor Sie die Kultur mit zwei Millilitern frischem Medium füttern. Als nächstes fügen Sie 50 zwei Mikrometer Durchmesser carboxylierte Latex FITC-konjugierte Perlen pro Zelle in die Kultur für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem Zell-Inkubator. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Platte ausgiebig fünf Mal mit einem Milliliter frische PBS pro Wäsche, um die extrazellulären Perlen zu entfernen und zufällig 100 Zellen zu bilden, um die Zellen zu zählen, die intrazelluläre Perlen enthalten.
Für einen Opsonisationstest zwei Mal 10 bis zum achten Schaf rote Blutkörperchen oder SRBCs mit 50 Mikroliter Kaninchen Anti-SRBC Immunglobulin M oder IgM für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann inkubieren Sie die opsonisierten SRBCs mit 50 Mikrolitern C5-mangelhaftem humanem Serum für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die C3b- und C3b-Inhibitoren zu reparieren, die Fragmente auf den IgM-beschichteten SRBCs ergänzen. Als nächstes aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 100 Mikroliter von einem mal 10 zu den sieben opsonisierten SRBCs pro Milliliter Medium zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, die ein mal 10 zu den vierten über Nacht kultivierten murinen Makrophagen pro Brunnen enthält.
Inkubieren Sie die SRBC-Mausmakrophagen-Kokultur für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und entfernen Sie dann die ungebundenen SRBCs, indem Sie mit 100 Mikroliter ammoniumchloridkaliumlysepuffer für eine Minute waschen. Nachdem die ungebundenen SRBCs entfernt wurden, spülen Sie mit 100 Mikroliter Medien ab. Lyse die verbleibenden Zellen mit 0,1%Natriumdodecylsulfat und behandeln die Lysate mit 50 Mikroliter 2, 7-Diaminofluoren ergänzt mit 3%Wasserstoffperoxid und sechs Molharnstoff.
Messen Sie dann die Absorption der hämoglobinkatalysierten Fluorenblaubildung auf einem Spektralphotometer bei 620 Nanometern. Verwenden Sie eine Standardkurve bei 620 Nanometer Absorptionswerten mit bekannter Anzahl von SRBCs, um die Anzahl der opsonisierten SRBCs zu bestimmen, die phagozytisiert sind. Um die von Mustererkennungsrezeptor-vermittelte Phagozytose zu bewerten, waschen Sie zweitägige kultivierte Maus-Primär-Alveolar-Makrophagen mit einem Milliliter PBS und behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikroliter frischem Medium, das 100 Alexa Fluor-488 konjugierte Zymosan-A-Biopartikel enthält.
Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius die Phagozytose mit 500 Mikrolitereeis PBS festnehmen und die Zellen fünfmal mit einem Milliliter PBS pro Waschgang ausgiebig waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und die Zellen fünfmal waschen, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 500 Mikrolitern frischer PBS für die Bildgebung unter Differentialinterferenzkontrast und Fluoreszenzkanal bei 488 Nanometern abdecken, um die Anzahl der Zymosan-A-Biopartikel-haltigen Alveolarmakrophagen zu quantifizieren.
Für in vivo alveolar Makrophagozytose-Auswertung, bestätigen Sie das angemessene Niveau der Sedierung durch mangelnde Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus und legen Sie die Maus auf einem flachen Brett mit einem Kunststoffdraht unter den oberen Schneidezähnen. Legen Sie die Maus in eine halb liegeförmige Tribüne in 45-Grad-Position mit der ventralen Oberfläche nach oben und verwenden Sie gekrümmte Zangen, um die Zunge herauszuziehen und zu unterdrücken. Dann legen Sie einen Mikrosprayer zwischen den Stimmfalten ein, um 50 Mikroliter von fünf mal 10 in die Lunge des anästhesierten Tieres zu verabreichen.
Um zu bestätigen, dass sich die Mikrosprühnadel in der Luftröhre befindet, bewegen Sie die Spritze vorsichtig und beobachten Sie die Stimmfalten auf beiden Seiten der Nadel. Eine Stunde nach der Infektion, sammeln Sie die Spülflüssigkeit, wie gerade gezeigt und Pellet der Alveolar Makrophagen durch Zentrifugation. Setzen Sie ein mal 10 bis zu den dritten Zellen in 100 Mikrolitern frischer PBS für Zytozentrifuge auf eine Glasrutsche.
Dann differenziell flecken die zytospun Dias für Alveolar Makrophagen, Neutrophile, und Lymphozyten, nach den Standard histochemischen Protokollen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 100 alveolare Makrophagen aus, um den Prozentsatz der Zellen zu quantifizieren, die bakterien phagozytosiert haben. In der ersten In-vivo-Bakterien-Clearance-Studie intratracheal injizieren eine subletle Dosis von etwa 2,5 bis fünf mal 10 die fünfte koloniebildende Einheiten pro Milliliter P.aeruginosa in anästhesisierte wildArt und mutierte Mäuse und messen das Körpergewicht jedes Tieres jeden Tag für sechs Tage.
In der zweiten Studie injizieren Sie einen neuen Satz von wilden und mutierten Mäusen mit einem tödlichen dreimal 10 zu den sieben koloniebildenden Einheiten pro Milliliter Dosis von P.aeruginosa und erfassen Sie die Sterblichkeit innerhalb von zwei Tagen nach einer Injektion, wobei das gesamte Lungengewebe zum Zeitpunkt des Todes oder zwei Tage nach der Injektion zur Quantifizierung der Lungenbakterienbelastung bei Einer Spitzeninfektion gesammelt wird. Nach der Ernte der Lunge die Lungenproben in kleine Stücke auf Eis schneiden und die Lungenfragmente mit einer angepassten elektrischen Homogenisator-Einstellung homogenisieren. Dann Platte 100 Mikroliter Homogenat auf Pseudomonas Isolation Agar Platten in 10-fach seriellen Verdünnungen.
Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die primäre alveolare Makrophagenphagozytose der FITC-Latexperlen nach einer Stunde Inkubation auftritt, wobei TRIM72-Knockout-Makrophagen eine signifikant höhere phagozytische Fähigkeit zeigen. Umgekehrt führt die Überexpression von TRIM72, einem Protein mit unbekannter Funktion in murinen Makrophagenzellen, zu einer mehr als fünffachen Abnahme der Komplementphagozytose. Alexa fluor-488 konjugierte Zymosan-A-Partikel werden jedoch in gleicher Menge durch primäre Alveolar-Makrophagen aufgenommen, die entweder von Wild-Typ- oder Knockout-Mäusen isoliert werden.
Die Differenzfärbung von BALF, die von wilden Typ- und Knockout-Tieren geerntet wird, zeigt eine ähnliche Anzahl von Makrophagen, aber eine höhere phagozytische Fähigkeit für die Makrophagen, die von Knockout-Mäusen geerntet werden. Darüber hinaus zeigen TRIM72 Knockout-Mäuse eine schnellere Erholung ihrer Körpergewichte, halten ihr Überleben aufrecht und weisen eine geringere bakterielle Belastung auf als Wildtiere nach der verabreichung von P.aeruginosa. Mit dieser Technik können andere phagozytische Prozesse analysiert werden, die für die Lungenentzündung wichtig sind, wie z. B. die neutrophile Phagozytose und der relative Beitrag anderer Phagozyten bei der Bakterienclearance.
In Kombination mit pharmakologischen Inhibitoren, adaptivem Transfer und transgenen Tieren kann diese Technik Forschern helfen, die molekulare Komponente bestimmter Phagozytose-Typen für die Phagozyten von Interesse zu erforschen.
