The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

HINWEIS: Alle Tiere sollten untergebracht und in Übereinstimmung mit der Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) in der Einrichtung genutzt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der Case Western Reserve University IACUC zugelassen. 1. Transgene Tiere <ol><li> Verwenden Sie handelsüblichen fluoreszierenden Reporter-Mäuse zu Axonen (Thy-1 YFP H) 50 und Mikroglia / Monozyten kennzeichnen (CX3CR1 GFP / GFP 51; siehe Liste der Materialien). Diese Mäuse sollte gekreuzt und als einzelne Brutkolonien nach institutionellen Tierpflegerichtlinien eingehalten werden. </li></ol> 2. Knochenmark-Chimären <ol><li> Identifizierung der Tiere, die mindestens 8 Wochen für den Einsatz als Empfängertiere sind. </li><li> Zeigen Wirtstiere in einer kreisförmigen Bestrahlung Haltekäfig entwickelt, um die Maus in einer Position zu halten, um auch, Ganzkörperbestrahlung zu gewährleisten. </li><li> Zeitschaltuhr auf eine Cäsium (Cs-137) Bestrahlungs eine ganze Körperstrahlung dos verwaltenAlter von 800-1.000 Rads an die Tiere nach Herstellerangaben (Beispiele hier gezeigten Rads 980). </li><li> Zurück Tiere in ihre Käfige für mindestens 4 Stunden ruhen. </li><li> Wählen Spendertieren der entsprechenden Genotyp (siehe 2A), als die Quelle der Mark-Vorläuferzellen. HINWEIS: Die entsprechenden Spender sind Tiere, die verschiedene linienspezifischen fluoreszierenden Reporter von dem Host zu verschiedenen Zellpopulationen oder eine des gleichen Genotyps als Kontrollen zu identifizieren. </li><li> Füllen einer Petrischale mit 70% Alkohol, und eine zweite Schale mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medien und einer 40 um Zellsieb in den Medien eingeweicht. Füllen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen mit RPMI-Medium. Halten Sie die Gerichte und Röhrchen auf Eis. </li><li> Opfern die Spendertiere von CO 2 Ersticken gemäß gültiger Richtlinien. Reinigen Sie die Haut und das Fell durch Einweichen der gesamten Tier mit 70% Ethanol bis alle Fell nass ist. </li><li> Entfernen Sie die skin vom unteren Hälfte des Tieres durch Schneiden um den mittleren Teil und ziehen die Haut nach unten über die Hinterbeine, um die Beinmuskulatur vollständig freizulegen. </li><li> Entfernen Sie die Tibia durch vordere Überdehnung im Kniegelenk, um den Knochen verrenken, dann mit einer sterilen Pinzette und Schere, schälen und Muskeln von beiden Enden der Tibia. Legen Sie die Knochen in der Petrischale mit Alkohol für bis zu 30 Sekunden, dann Transfer zum Zellsieb in der Petrischale mit den Medien. </li><li> Verrücken das Hüftgelenk und abziehen, die Muskeln auf den Oberschenkelknochen befestigt, platziert den Oberschenkelknochen kurz in Alkohol und dann legen Sie sie in der gleichen Zelle Sieb in der Schüssel. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze, verwenden sterilen Schere abzuschneiden beide Enden der Knochen und legen Sie eine 21-Gauge-Nadel auf einer 1-ml-Spritze in das Ende des Knochens. Spülen Sie die Mark in den 15-ml-Erlen mit Medien. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Knochen. </li><li> Verwendung der Rückseite des Kolbens aus einer 3 ml-Spritze endet Stauch Knochen in der ZellSieb auf der Petrischale mehrere Zellen zu extrahieren. </li><li> Setzen Sie den Filter auf einem 50 ml konischen Röhrchen und übertragen Sie Medien mit abgesaugt Zellen aus dem 15 ml konischen Röhrchen. Benutzen Sie die Rückseite des Kolbens, um das Mark, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, zu zerschlagen. Die 15 ml konischen Röhrchen, Knochenfragmente und die Zelle-Sieb mit 30 ml Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen waschen. </li><li> Zentrifugiere die Zellen 5 min bei 500 × g Zellen zu pelletieren. </li><li> Lyse der roten Blutzellen, die mit 2 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer für 2 min. Quenche die Lysepuffer mit 10 ml Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum. Bei 500 xg für 5 bis 10 min zu pelletieren. </li><li> Wasche die Zellen einmal in 10 ml RPMI-Medium und zweimal in Kochsalzlösung, Zentrifugieren bei 500 × g für 5-10 Minuten für jeden Waschvorgang zu pelletieren. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 3 x 10 6 Zellen in 200 ul Kochsalzlösung. </li><li> Über 3 x 10 6 Markszellen über die Schwanzvene Injektion in irradiated Empfängermäuse. </li><li> Zeigen angesäuertem Wasser (pH 3,0) in den Empfänger Käfig und lassen Mäusen zu erholen. HINWEIS: Mäuse, die die Transplantation wird innerhalb von 10-14 Tagen nach dem Eingriff zu sterben scheitern. </li><li> Nach 8 Wochen überprüfen Mark Rekonstitution durch die Untersuchung des peripheren Blutes Immunzellen mittels Durchflusszytometrie (2B-C). </li></ol> 3. Rücken Spalte Quetschverletzung HINWEIS: Wählen Sie die entsprechende Chimäre Tiere oder Doppel transgene Tiere für die Operation auf der Grundlage des gewünschten Experiments. Tiere entweder mit der Bezeichnung ansässig oder Knochenmark-Zellen wurden in vorherigen Schritten erstellt. <ol><li> Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Rongeure, Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten Gewebe, Nadeltreiber und Wundklammern. </li><li> Bereiten Medikamente den Mäusen Schmerzkontrolle zu verabreichen. Bupernex und Marcain werden üblicherweise zur Schmerzkontrolle verwendet. Verwenden Sie geeignete Medikamente wie erforderlich einnd von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. </li><li> Induzieren Anästhesie mit 4% Isofluran und halten mit 1-2% Isofluran, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro min zu erreichen. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres bis zur Trockenheit unter Narkose zu verhindern, und bestätigen Sie fehlende Reaktion zu Fuß Prise. Pflegen Sie die Temperatur mit einem Heizkissen und die Temperatur mit einem rektale Sonde überwachen. </li><li> Rasieren Sie die Rückseite der Maus mit einem elektrischen Rasierer über die gezielte Rückenmarksebene und dann dreimal Wischen Sie die Fläche mit PVP-Jod, gefolgt von zweimal mit 70% igem Alkohol. Legen Sie das Tier auf einem sterilen Tuch und decken das Tier mit einem anderen sterilen Tuch mit einem Loch an einem geeigneten Ort, um die Operationsstelle zu visualisieren geschnitten. Behalten Sie alle Tools auf sterilen Tüchern in der gesamten Operation. </li><li> Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie an der gewünschten Rückenebene mit Iris Schere, um die Muskeln auf der Rückseite des Tieres aus. </li><li> Unter einem dissektierender Mikroskop, schneiden Sie die Rückenmuskulatur, einschließlich des Trapezius und der Bänder des großen Rückenmuskeln entlang der Mittellinie, wo sie auf die Rückendornfortsätze anzuhängen, und setzen die Wirbelsäule. </li><li> Entfernen Sie die Rotatoren zwischen den dorsalen und Querfortsätze der Wirbelkörper, um die Schicht des spezifischen Wirbel offenbaren entfernt werden (T11 in diesem Fall). Identifizieren T11 durch das Einsetzen der letzten nicht-schwimmende Rippe auf diesen Prozess. </li><li> Legen Spitzen Rongeure in den Raum über und unter dem Prozess entfernt und leicht anheben, um sicherzustellen, dass sie sicher an ihrem Platz auf der Wirbel Lamina aber nicht zu tief, um die Wirbelsäule verletzen. Schließen Rongeure in einer Bewegung, die Lamina zu entfernen. </li><li> Vergrößern Sie die Laminektomie, wie mit Hilfe der Knochenzangen, um kleine Teile des Restwirbel zu entfernen benötigt. </li><li> Messen Sie 1 mm von den Spitzen einer Pinzette # 4 von gegen einen Herrscher hielt sie und Markieren mit einem wasserfesten Stift. Messen Sie ein 1 mm in Trennung Wetteschen den beiden Zinken durch Halten der Zange gegen den Herrscher und befestigen Sie die maximale Breite der Spitzen bis 1 mm, indem ein Gummiring Zange in Position über die Welle der Zange. </li><li> Erstellung einer kleinen Öffnung durch den Einsatz eines 30-Gauge-Nadel durch die Dura an den beiden Punkten für die Zinken der Zange, um auf die Wirbelsäule. </li><li> Legen der Zange Zinken in einem 90 ° Winkel zu der Dura durch die Löcher bis zu einer Tiefe von 1 mm an den Seiten der Zange markiert, so dass der Filter über der Dura. Klemmen Sie die Zange schließen und halten Sie für 10 Sekunden. Mitteilung, und wiederholen Sie die Zange quetschen zwei weitere Male für insgesamt drei hält. Pinzette entfernen aus dem Rückenmark. </li><li> Genießen Sie ein Stück absorbierbarer Gelatineschwamm komprimiert in Kochsalzlösung und über den Verletzungsstelle. </li><li> Mit einer Laufstich, Naht der Muskel anstelle über die Laminektomie und getränkt Gelatineschwamm mit # 4 synthetische nicht resorbierbares Nahtmaterial aus Nylon. </li><li> Clip der Haut an Ort und Stelle mit 5 mm gewickelt clips. </li><li> Injizieren 10 ul Marcaine (1,0 mg / kg) in 490 &amp; mgr; l Kochsalzlösung subkutan um die Inzisionsstelle und 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulär in den Glutealmuskulatur. </li><li> Lassen Tier an einem warmen Pad erholen und Monitor für alle bei der Bewegung oder Lähmungserscheinungen in den hinteren Gliedmaßen. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Verwenden Sie keine Tiere, die beobachtbare motorische Defizite anzuzeigen. HINWEIS: Dieses Gedränge Läsion kann auf jeder Ebene entlang des Rückenmarks durchgeführt werden, praktisch, T10-L4 stellen weniger technischen Herausforderungen für die Bildgebung in Bezug auf die Atmung und die Stabilisierung Körperbewegung mit Schellen. Clamp Platzierung muss um den Brustkorb bei Brust Ebenen geändert werden, um Bild. </li></ol> 4. Intravital Imaging <ol><li> Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten von Gewebe, Nadel dFlüsse und Wundklammern. </li><li> Betäuben die Maus nach wie vor mit Isofluran. Induzieren Anästhesie bei 4-5% und pflegen bei 1-2% je nach Bedarf, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro Minute und ein Mangel an Reaktion auf Fuß Prise halten. Halten Sie die Maus beheizt, überwachen Atemfrequenz, wenn nicht die Abbildung und Tier Temperatur mit einem rektale Sonde kontinuierlich zu überwachen. </li><li> Reinigen Sie die Haut um die Wundklammern mit Betadine und Alkohol und entfernen Sie die Wundklammern nach Herstelleranweisungen. Sobald Wundklammern entfernt werden, entfernen Sie die Haare mit Nair bei Bedarf und reinigen Sie die Website erneut mit PVP-Jod und 70% Alkohol. </li><li> Wiederaufnahme der Haut mit einer Schere. Nehmen Sie die restlichen Nähte von Muskeln und ziehen Muskeln heraus mit Zangen, Schneiden mit der Schere, wenn nötig. </li><li> Unter einem Präpariermikroskop Erstellen Taschen für das Rückenmark Klemmen durch Schneiden des Muskels mit einer Schere an der Seite der Querfortsätze an dem Wirbel eines Wirbelhöhe oberhalb und unterhalb der laminectomy. </li><li> Zeigen Klammern um jede dieser Wirbel und festziehen. Nach Bedarf einzustellen, um Raum für Mikroskopobjektiv zu ermöglichen, die das Rückenmark zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark parallel zur Imaging-Plattform ist, und Gewebestabilität für die Bildgebung zu halten. Bei Atem Artefakt gesehen, stellen Klemmen entsprechend auf Bewegung im Bildfeld zu minimieren. </li><li> Decken Sie die Klemmen mit Parafilm. </li><li> Entfernen Sie die absorbierbarer Gelatine komprimierte Schwamm aus dem Rückenmark mit einer Pinzette vorsichtig Abgreifen so viele Teile wie möglich, auch das Entfernen so viel von Narbengewebe in den Meningen, wie möglich. Abdeckung ausgesetzt Rückenmark mit Kochsalzlösung und neuen Schwamm, wenn nötig. HINWEIS: Wenn eine Blutung auftritt von der umgebenden Muskeln, entweder überzeugter mit Schwamm oder ausbrennen, wie gebraucht. , Nehmen Sie jedoch darauf, dass das Rückenmark mit dem Brenneisen berühren. Decken Sie das Rückenmark entweder mit einem Stück feuchten Gewebe oder Gelatine Schwamm zusammengedrückt, wenn Ausbrennen. </li><li> Erstellen Sie eine well, um die Immersionsflüssigkeit durch erste Abdichtung der Haut und des Gewebes mit Vetbond und dann mit Zahnacryl den Aufbau einer gut zwischen den beiden Klemmen des Rückenmarks Halter und den Seiten des Tieres zu halten. Warten Sie, bis die Acryl Kuren. </li><li> Füllen Sie das auch mit künstlichen Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) und klicken Sie hier für eine Blutung auf der Operationsstelle. </li><li> Gegebenenfalls zu diesem Zeitpunkt einzuspritzen fluoreszierenden Gefäß Farbstoffe intravenös durch Injektion in die Schwanzvene, die Blutgefäße bei der Bildgebung zu markieren. HINWEIS: Fluorescent Dextran über 70 kDa wird häufig verwendet, wenn auch Quantenpunkte und fluoreszenzmarkierte Lektine als nützlich Schiff Farbstoffe dienen auch. 50 ul von 150.000 WM TRITC-Dextran wird typischerweise intravenös injiziert. </li><li> Physiologisch relevanten Immunzellbeweglichkeit zu erhalten, muss die Temperatur der Maus bei 37 ° C gehalten werden. Bewegen Sie die Maus auf eine Temperatur kontrollierten Umgebung unter dem Mikroskop für die Bildgebung und Überwachung des Tier korrekte anesThesia Niveau von Atemfrequenz und Fuß Prise. Überwachen Sie das Tier häufig während der Bilderzeugung zu bestimmen, der Narkosetiefe, mit dem Ziel, eine Atemfrequenz von 60 zu erreichen - 100 Atemzüge pro Minute. </li><li> Suchen Sie die Bildstelle durch das Mikroskop-Okular. </li><li> Stellen Sie die 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um ein Bild Z-Stapel jede 30-60 Sekunden dauern, um dynamische Bilddaten zu erhalten. </li><li> Sobald Bildgebungssitzung abgeschlossen ist entfernen Sie das Tier von der beheizten Box. </li><li> Lösen Sie die Rückenklammern und entfernen Sie die Maus von den Klemmen. Ziehen Sie die Acryl gut von der Haut weg, während das Entfernen der Klemmen. </li><li> Wenn die Maus wieder abgebildet werden, legen Sie Kochsalzlösung getränkt Gelatine Druck Schwamm über das Rückenmark. Schließen Sie die Muskeln und Haut über der Operationsstelle. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere während der Genesung von Anästhesie. Wenn das Tier zeigt keine Anzeichen von neurologischen Defizit nach der Wiederherstellung, sollte das Tier eingeschläfert werden. Andernfalls einschläferndie Maus in einem CO 2 Kammer, bevor sie aus der Narkose tritt nach IACUC genehmigten Sterbehilfe-Protokoll. </li><li> Analysieren Fluoreszenzbilder mit Bildanalyse-Software, indem Sie den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Imaging Wechselwirkungen verschiedener Zelltypen in ihrer Mutter Gewebekompartimente beim anschließenden Pathologie in Echtzeit hat großes Interesse erzeugt. Innerhalb des dichten Netz des ZNS, Zell-Zell-Kontakt und Signalisierung mit benachbarten Zellen essentiell für die normale Funktion und zum Verständnis ZNS-Pathologie. Hier haben wir beschrieben, die Verwendung von 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie für die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb einer mechanischen Verletzung des Rückenmarks. Neben der Qualität der Chirurgie und Gewebepräparat, ist die mechanische Stabilität des Gewebes von größter Bedeutung für eine erfolgreiche Zeitraffer-Mikroskopie, insbesondere der Isolierung des Rückenmarks von Atembewegungsartefakte. Die Stabilität kann durch die Suche nach Bewegung des Rückenmarks unter einem Präpariermikroskop, die der Herzfrequenz oder Atem des Tieres entspricht beurteilen. Stabilität zu beurteilen ist sowohl während der Durchführung der Operation und auch unmittelbar vor Beginn der Bildgebung. Wenn der Animal nicht stabil ist, ist es angezeigt, die Platzierung und die Dichtheit der Rückenmark Klemmen erfolgen. Zelltyp-spezifische fluoreszierende Reportermausmodelle in Verbindung mit Knochenmark-Chimäre Ansätze haben die Identifizierung von monozytischen Zellen gegenüber Mikroglia und Axone erlaubt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Blut gewonnen Monozyten und Mikroglia sind nicht für die Sekundär axonalen Schäden nach Trauma mit Hilfe der hier 43 beschriebenen Methodik verantwortlich. Dextran konjugierten Schiff Farbstoff ermöglicht die Ermittlung von Schiffen sowohl Sehenswürdigkeiten zuleiten und Verletzungen der Gefäßintegrität zu identifizieren. Die Auswahl des geeigneten fluoreszierenden Reportermausmodell ist kritisch, damit die richtige Identifizierung der gewünschten Zelltypen, die abgebildet werden. Entwicklung von Fluoreszenzmausmodelle, die für die Studien geeigneten unternommen sind auch entscheidend für den Erfolg von Experimenten. Die Unterscheidung zwischen den beiden Populationen von phagozytischen CX3CR1 + / GFP </sup&gt; Zellen im ZNS ist traditionell schwierig. Wie hier gezeigt ist, kann eine gemeinsame immunologische Technik, Bestrahlung Chimären verwendet werden, um strahlungsresistent, ZNS-residenten Mikrogliazellen aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen unterscheiden. Die Bestrahlungsverfahren hat das Potenzial, die Blut-Hirn-Schranke schädigt, ändern Zellphänotypen, so Verwendung dieses Modells sollte sorgfältig geprüft werden. Das Ausmaß dieser Veränderungen unterscheidet sich mit Bestrahlungsdosis sowie Dauer der Erholungsphase, und ihre Auswirkungen auf verschiedene Entzündungsmodellen noch nicht vollständig untersucht. Die Wirkungen der Bestrahlung auf CNS Blut-Hirn-Schranke kann durch Abschirmung des Kopfes während der Bestrahlung zu minimieren, und dies hat sich gezeigt, dass die Zellinfiltration in das Rückenmark nach der Bestrahlung zu verringern, auch wenn das Rückenmark nicht direkt abgeschirmte 52. Hier haben wir beobachtet, dass die Anzahl von Zellen infiltriert in das ZNS im stationären Zustand als Ergebnis der Chimäre Generation unbedeutend ist im Gegensatz zu den taubener von Zellen in die Läsion. Andere alternative Modelle zu berücksichtigen sind Arzneimittel-induzierter Chimären 52 oder parabiotic Mausmodellen 53. Hier haben wir eine bestimmte, einfache und reproduzierbare geringe Verletzungsmodell, das in einer Läsion an der dorsalen weißen Substanz des Rückenmarks, die einfach zu Bild unter Verwendung der 2-Photonen-Mikroskopie ist Ergebnisse präsentiert. Dieses Verfahren stellt auch einen messbaren Läsionen um den Grad der axonalen Sterben in der dorsalen Säulen, die in der Literatur mit komplementären festen Gewebeanalyse 16,18,43,48,54 gekoppelt testen. In diesem Modell, Tiere zeigen nur geringe Defizite und benötigen keine besondere Pflege nach der Verletzung. Zukünftige Studien unter Verwendung der hier beschriebenen dorsalen Säule Quetschverletzung und bildgebenden Verfahren können leistungsfähige Screening-Tools, um die Wirksamkeit der Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu beurteilen. Diese Behandlungen können niedermolekularen Inhibitoren, Drogen, Zellprodukte, Gewebetransplantate und kombinatorische Behandlung schließens. Das Zusammenspiel von Makrophagen, Mikroglia und Neuronen sind wahrscheinlich auch eine Rolle bei anderen Krankheitsmodellen im Rückenmark, einschließlich multipler Sklerose, Tumoren, Meningitis und amyotrophe Lateralsklerose spielen, und diese Technik kann bei der Untersuchung dieser Erkrankungen sowie sein .

Die Entzündungsreaktion auf einer Erkrankung oder Verletzung im zentralen Nervensystem (ZNS) ist wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Wechselwirkungen zwischen Immun- und residenten Zellen innerhalb des Gewebes. Untersuchungen dieser zellulären Interaktionen im Rückenmark sind von besonderem Interesse in dem lebenden Tier. Der einzige leicht zugänglich CNS weiße Substanz-Trakt ist im dorsalen Säulen der Wirbelsäule, so dass dies ein wichtiges Gebiet, auf dem sich auf die Verbesserung machbar experimentellen Ansatz konzentrieren. Diese Untersuchungen haben aufgrund der technischen Schwierigkeiten beim Zugang zu und zur Stabilisierung des ZNS für die Bildgebung begrenzt. Live-Bildgebung im Rückenmark wurde in einer Verletzung des Rückenmarks über ein paar Stunden nach der ersten Beleidigung beschrieben zuvor 1-13, jedoch nur wenige Studien haben angesprochen Zellbewegung. Die traumatische Querschnittlähmung ist eine komplexe Umgebung, mit Neuronen, Astrozyten, Fibroblasten, NG2 Vorläuferzellen und Immunzellen including Mikroglia, Neutrophilen, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen 14,15. Makrophagen sind die Teilmenge der Immunzellen für die Phagozytose in der Läsion verantwortlich Infiltrieren aus der Zirkulation. Die Rolle dieser phagozytischen Zellen ist diskutiert worden, mit Berichten hervorgeht, dass diese Zellen sowohl schädlich und Schutzrollen in das verletzte Gewebe zu nehmen. Diese Rollen reichen von steigenden sekundären axonalen Sterben nach einer Verletzung und in einer Art und Weise phagozytischen 16-22 handeln, die Annahme auf einer Wundheilungs Phänotyp und abnehmende Funktionsdefizite in der verletzte Tier 21,23,24. Zuvor versucht, Makrophagen von Mikroglia in erster Linie auf die Morphologie in gesundem Gewebe verlassen zu unterscheiden. , Aktivierte Mikroglia und Makrophagen exprimieren jedoch viele der gleichen Markierungen und Anzeige unterscheiden Morphologie nach einer Verletzung 25-29, so dass die Trennung der verschiedenen Aktivitäten dieser Zellen schwer zu studieren based auf diese Faktoren allein 30. Diese Zellen können durch differentielle Expression von CD45 mit Durchflusszytometrie 33,34 getrennt werden, wobei diese Vorgehensweise ist bei der Unterscheidung dieser Zelltypen in vivo weniger nützlich. Verwendung differentielle Expression von CCR2 und CX3CR1 Mikroglia und Makrophagen wurde ebenfalls untersucht, obwohl die dynamischen Veränderungen in der Expression dieser Marker Monozyten differenzieren sich zu Makrophagen genaue Analyse 35,36 erschweren. Mikroglia sind die Immunzellen Wohnsitz im ZNS und ergeben sich aus Dottersack Vorläuferzellen während der fetalen Entwicklung, während Makrophagen aus Knochenmarksvorläuferzellen abgeleitet und geben Sie den verletzten ZNS nach einer Beleidigung 31,32. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung von Morphologie, diese beiden Zelltypen zu unterscheiden, ist das Knochenmark mit Vorläufern von einem Spendertier ersetzen exprimieren eine nachweisbare Markierung in die Makrophagen aus den Donor-Vorläufer abgeleitet ist, unter Beibehaltung des CNS resident, recipabler abgeleitete Mikroglia. Diese Knochenmarks chimären Modelle sind allgemein bei vielen anderen Anwendungen 37-40 verwendet. Dieses Verfahren hat eindeutige Einschränkungen mit Verletzung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch Bestrahlung oder zytotoxische Medikamente zur Markvorläuferzellen zu beseitigen im Wirt, wodurch seine Verwendung in bestimmten Applikationen Begrenzungs verursacht sind. In letzter Zeit werden funktionale Unterschiede zwischen Mikroglia und Makrophagen im zentralen Nervensystem beginnen, mit Hilfe der Durchflusszytometrie, Gen-Chip-Array-Analyse und Chimärismus Methoden 24,26,41-44, die sehr nützlich in der Zukunft erweisen wird erkennbar. Obwohl die Trennung dieser beiden Zelltypen schwierig bleibt, ist das Verständnis ihrer einzigartigen Funktionen, die zu zielgerichteten Behandlungs von Erkrankungen, die sowohl Mikroglia und Makrophagen im ZNS beteiligt wichtig. Beschreibung von zellulären Wechselwirkungen innerhalb der Läsion des Rückenmarks wurde hauptsächlich aus Untersuchungen, die Zellkultur-Modellen kommen. Dies ist due auf die Herausforderungen, mit bildgebe sowohl der Querschnittlähmung und Immunzellen zusammen in einem lebenden Tier beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Rückenmarksverletzungen von unterschiedlicher Art und Schwere sind Prellung Modelle 45,46, Pin-Stichverletzungen 2, Platzwunde 47 und die hier beschriebenen 16,18,48 dorsalen Säule Quetschverletzungen. Entzündung in der Hirnhaut steigt mit der Schwere der Verletzung und stellt besondere Herausforderungen für die Implantation von Fenstern oder Operationen für serielle Bildgebung. Einige dieser Herausforderungen sind: die Infiltration von Phagozyten als auch die Erzeugung von Fasergewebe über der Operationsstelle. Einige dieser Probleme können durch die Schaffung von kleineren Läsionen und für den freiliegenden Rückenmark mit nicht immunogen Wundversorgung zwischen Dura und den paraspinous Muskeln, um die spätere Wiedereröffnung der Operation ermöglichen überwunden werden, wie hier getan wird, um die Hinterstrang Quetschverletzung studieren . Die Fähigkeit, Bild nur die dorsale Teil des Spin-al Kabel begrenzt auch die Wahl der Verletzung, da Prellung Modelle in erster Linie verursachen Schäden am Zentralstecker, oft Schonung der meisten dorsalen Teil der Hinterstränge, insbesondere zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung 45,49. Daher beschreiben wir eine einfache Verletzungsmodell, das eine saubere, wiederholbare, rechteckig geformte Läsionen, die für sowohl die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb der Verletzung, und für eine einfache Quantifizierung von axonalen Position relativ zu der Läsion ergibt.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Eine schematische Darstellung der dorsalen Säule Stauch Läsion ist in 1A gezeigt. Nach der Läsion wird das Tier hergestellt und intravitale Mikroskopie mit spinalen Klammern (1B) stabilisiert. Ein Bild unmittelbar nach der dorsalen Säule Quetschverletzung genommen wird, zeigt eine deutlich sichtbare rechteckigen Läsion mit einer Pinzette Zinken Einfügepunkte, die eindeutig identifizierbar sind. Axone an der Verletzungsstelle sind über die Spannweite der gesamten hinteren Säule (1C) durchtrennt wird. Die Integrität von Blutgefäßen erhalten bleibt und keine Hinweise auf eine Gefäß Austritt von Farbstoff wurde durch Fluoreszenz detektiert. Zur Serienbild der gleichen Läsion über Wochen durchzuführen, können die Muskeln und die Haut über der Laminektomie aus dem Wieder Exposition genäht werden. Ähnliche Läsion Morphologie zu späteren Zeitpunkten (1D, E) ersichtlich. 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen noch sichtbar, aber die Läsion hat damit begonnen, in der Größe d erhöhenue zu Sekundärschäden durch eine Entzündung verursacht. Die Axone am kaudalen Ende der Läsion wurden aus dem anfänglichen Ort der Verletzung durch ein Verfahren namens &quot;axonale Absterben&quot; eingefahren. Die Axone im rostralen Ende der Läsion zeigte Wallerian artigen Degeneration (1D, E). Zwischen den Tagen 5 und 22 nach der Verletzung, die Größe der Läsion stabilisiert. Gleichzeitig kann ein großer Zustrom von CX3CR1 + Zellen beobachtet Infiltrieren in und um die Stauch Läsion während dieser Zeitpunkte werden, obgleich die Identität dieser Zellen (Mikroglia gegen Makrophagen) nicht bei der Herstellung, wie in Figur 1 gezeigt unterscheidet. Um das Verhalten von Mikroglia und Makrophagen im Gedränge Läsion Mikroumgebung zu unterscheiden, wurde eine Strahlungs Chimäre Modell verwendet (in 2A beschrieben). Zuerst werden die Knochenmarksvorläuferzellen eines CX3CR1 + / GFP-Maus mit nicht-fluoreszierenden Donor-cel ausgetauschtls, also nur GFP + CNS fremde Mikrogliazellen sind durch Fluoreszenz-Bildgebung sichtbar. Die Effizienz des Mark Rekonstitution mittels Durchflusszytometrie Prüfung des peripheren Blutes 8 Wochen nach Marktransplantation (Abbildung 2B, C) ​​bestätigt werden. In 2B F4 / 80 und GFP-positive Makrophagen, in blau, in einem CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimären Maus erkannt wird, in dem einige GFP negativ, aber F4 / 80 positive Monozyten sind ebenfalls vorhanden. In 2C ohne doppelte positive F4 / 80 und GFP-positive Zellen sind nach dem Austausch CX3CR1 + / GFP Empfängerknochenmark mit Wildtyp-Knochenmark verlassen. Vor Verletzungen, sind Mikroglia gleichmäßig im Rückenmark verteilt Anzeigen eines ruhenden, verzweigten Morphologie (Figur 2D). 8 Tage nach Verletzung, kann nur ein paar Mikrogliazellen in und um die Läsion nachweisbar. Diese Mikrogliazellen zeigen eine amoeboid Morphologie (2E). Zweitens KnochenMark-Vorläuferzellen in einer nicht-fluoreszierenden Maus werden durch Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus ersetzt daher Rendering-Knochenmark stamm CX3CR1 + Monozyten / Makrophagen durch GFP-Fluoreszenz sichtbar ist (2A). Vor der Verletzung, die nur GFP + Zellen nachgewiesen sind weitgehend perivaskuläre, von denen berichtet wurde, um sein Knochenmark und ständig umdrehen regelmäßig 28 (2F). Nach Quetschverletzung kann CX3CR1 + / GFP Zellen entlang der Innenseite der Blutgefäße rund um die Läsion (2H-J) zu sehen ist, und die Läsion Zentrum ist mit infiltrierenden CX3CR1 + / GFP Makrophagen (2G) gefüllt. Zeitraffer-Aufnahme der dorsalen Säulen können für bis zu 6 Stunden durchgeführt werden. In Figur 3 wird gezeigt, eine nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus unmittelbar nach der Verletzung in dem Zellen aus dem Kreislauf zu sehen sein kannn Auszug aus dem Blutgefäß zu der Läsion Kern und die innerhalb der Verletzungsstelle (3A, B; Supplemental Film 1). Die Bildanalyse unter Verwendung der Fluoreszenzintensität um Zellen zu identifizieren können die Pfade durch Makrophagen (3A, B; Supplemental Film 1) genommen zu verfolgen. Statistik von der Bildanalyse abgeleitet zeigen die durchschnittliche Beweglichkeit der Makrophagen in der Läsion ist 3,6 um / min (3D). Schließlich wird bei 22 Tage nach der Verletzung, Axonen, Mikroglia und Makrophagen, kann innerhalb der Läsion zeigt den Bereich der Bildgebung detektiert werden soll über lange Zeiträume (Supplementary Movie 2) stabil. <img alt="Figur 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: Aufbau und sequentielle Bildgebung des dorsalen Säule Quetschverletzungen. (A) Die RückenSpalte Quetschverletzung wird durch Entfernen der Dornfort des Wirbels auf der Ebene von Interesse durchgeführt. Zangen sind in den dorsalen Säule des Rückenmarks 1 mm voneinander eingesetzt und werden dann geschlossen 3 mal um den in lila dargestellt Läsion zu erzeugen. (B) Das Tier wird dann mit Rückenmark positioniert Schellen, um die Stabilität für intravital Bildgebung zu erhalten. (C) Unmittelbar nach der Verletzung, kann die Zange Insertionsstellen (rot oval) und der rechteckige Quetschverletzung Volumen (graue Box) eindeutig identifiziert werden. Axone in den dorsalen Wurzeln zu sehen ist (weiße Pfeile) sowie die verletzten Enden der Axone auf der kaudalen Seite der Läsion (gefüllte Pfeilköpfe). (D) 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen (rot oval ), und das Ausmaß der Läsion (grauer Kasten) noch leicht sichtbar gemacht werden. Die Läsion hat sich seit der ersten Beleidigung zu. Axone unterziehen Waller artigen Degeneration kann rostral zur Läsion (offene Pfeilspitzen) in additi sehenauf, um Axone in den hinteren Wurzeln (weiße Pfeile) und die Enden der verletzten Axone (weiße Pfeilspitzen). (E) 22 Tage nach der Verletzung, ist die Läsion noch erkennbar mit ähnlichen Abmessungen der Verletzung nach 5 Tagen. Achten Sie auf die große Anzahl von CX3CR1 + Zellen in und um die verletzte Stelle. Funktionen beschriftet sind die gleichen wie in (D). Alle Maßstabsbalken = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2: Aufbau von chimären Mäusen CX3CR1 + / GFP-exprimierenden CNS fremde Mikrogliazellen oder Knochenmark-abgeleitete Makrophagen in der dorsalen Säule verknallt Läsion zu verfolgen. (A) Eine schematische Darstellung des chimären Mäusen Erzeugung mit entweder CX3CR1 + / GFP exprimierenden microglia oder Makrophagen. Zuerst werden Thy-1 YFP H Mäusen bestrahlt und das Knochenmark wird mit Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus isoliert rekonstituiert, was zu einer chimären Maus, deren Makrophagen GFP +. Zweitens sind Thy-1 YFP H / CX3CR1 + / GFP-Mäuse bestrahlt und das Knochenmark wird mit Markzellen von einem nicht-fluoreszierenden Maus isoliert rekonstituiert, wodurch eine chimäre Maus, deren Mikroglia GFP +. (B) Beispiel eines Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in das Blut von einem chimären Tiers mit einem CX3CR1 + / GFP Markspender in einem bestrahlten C57BL / 6-Empfänger transplantiert. Zellen aus den CX3CR1 positiven Spendern, die positiv für sowohl GFP und F4 / 80 abgeleitet werden gezeigt in der blau unterlegt Bereich. (C) Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in einem chimären Tier mit einem C57BL6 Spendermark in eine ir transplantiertabgestrahlte CX3CR1 + / GFP Empfänger. Beachten Sie das Fehlen von Doppel-positive CX3CR1 + / GFP und F4 / 80 Zellen innerhalb der blaue markierte Bereich. (D) Ein Intravital Zwei-Photonen-mikroskopische Momentaufnahme einer Maus aus dem ersten chimären Schema und zeigt GFP + Mikroglia mit verzweigten Morphologie im Rücken Spalte (Pfeilspitze). Diese Zellen werden unter Axone (gelb) in der Hinterwurzel und der dorsalen Säule durchsetzt. Balken = 100 um. (E) Intravital Imaging der gleichen Maus in (B) von 8 Tagen nach dorsalen Säule Verletzungen offenbart ein paar CX3CR1 + Mikroglia mit großen und amoeboid förmigen Zellkörper, die ohne Verfahren (Pfeilspitze) sind. Balken = 100 um. (F) Snapshot einer Maus aus der zweiten chimären Schema in (A) und zeigt kaum GFP + Makrophagen, im ZNS Parenchym. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (G) Intra Abbildung der gleichen Maus (F) 8 Tage nach der dorsalen Säule Schädigung zeigt alArge Zustrom von Makrophagen in und um die Läsion. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (H) eine höhere Vergrößerung Bild CX3CR1 + Blut abgeleiteten Zellen in Kontakt mit den Behältern in der unversehrten Tier. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m. (I) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, aus dem Inneren des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m. (J) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, von außerhalb des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3 :. Vertreter Zell Tracking-Daten in einem nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus sofort nach dorsalen Säule verknalltVerletzung. Von den CX3CR1 + Zellen in (A) genommen (A) Eine Momentaufnahme der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen rund beschädigt Axone (gelb) von Zusatz Film 1 unmittelbar nach einem dorsalen Säule Quetschverletzungen. (B) Die Wege (grau) in einem 110 min Intravital Imaging-Sitzung. (C) Eine Zeit codierte Darstellung der Tracks in (B). Spuren sind auf der Grundlage ihrer Zeit innerhalb der gesamten 110 Minuten Film gefärbt, wie in dem Zeitbalken angezeigt. (D) Histogramm der Gesamtbeweglichkeit der CX3CR1 + Zellen. Alle Maßstabsbalken sind 30 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Ergänzende Film 1: Vertreter Intravital Film unmittelbar nach dem dorsalen Säule Quetschverletzung im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + <strong&gt; / CX3CR1 GFP / + Maus. Intravitalrücken Bildgebung wurde unmittelbar nach einer dorsalen Säule Quetschverletzungen an T11-Ebene durchgeführt. Rechte Bild zeigt die Bewegung der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen. Die Wege der Bewegung der Zellen werden als weiße Spuren auf der linken Seite gezeigt. Die Verletzung an der oberen linken Ecke. CX3CR1 + Zellen, in Reise in die Stelle der Verletzung entlang dieser Spuren werden. Axone sind in gelb dargestellt. Maßstabsbalken = 40 um. Gesamtzeit: 110 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 300x. Ergänzende Movie 2:. Vertreter Intravital Film bei 22 Tagen nach dorsalen Säule verknallt Läsion im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + Maus Abgebildet ist ein Vertreter Film in einer Maus 22 Tage nach der ersten dorsalen Säule verknallt genommen Verletzungen am Rückenebene T11. Die injry ist an der oberen rechten Ecke des Rahmens befinden. Axone (gelb) aufsteigend rostral werden unten rechts angezeigt. Die Dorsalvene und Blutgefäße sind mit TRITC-Dextran (rot) gekennzeichnet. CX3CR1 + Zellen innerhalb der Verletzung, bewegen sich mit einer geringeren Geschwindigkeit verglichen mit denen unmittelbar nach der Verletzung. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. Gesamtzeit: 90 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 600x.

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Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Serie: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Medizin

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Immunologie und Infektion

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Zusammenfassung

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