The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

HINWEIS: Alle Tiere sollten untergebracht und in Übereinstimmung mit der Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) in der Einrichtung genutzt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der Case Western Reserve University IACUC zugelassen. 1. Transgene Tiere <ol><li> Verwenden Sie handelsüblichen fluoreszierenden Reporter-Mäuse zu Axonen (Thy-1 YFP H) 50 und Mikroglia / Monozyten kennzeichnen (CX3CR1 GFP / GFP 51; siehe Liste der Materialien). Diese Mäuse sollte gekreuzt und als einzelne Brutkolonien nach institutionellen Tierpflegerichtlinien eingehalten werden. </li></ol> 2. Knochenmark-Chimären <ol><li> Identifizierung der Tiere, die mindestens 8 Wochen für den Einsatz als Empfängertiere sind. </li><li> Zeigen Wirtstiere in einer kreisförmigen Bestrahlung Haltekäfig entwickelt, um die Maus in einer Position zu halten, um auch, Ganzkörperbestrahlung zu gewährleisten. </li><li> Zeitschaltuhr auf eine Cäsium (Cs-137) Bestrahlungs eine ganze Körperstrahlung dos verwaltenAlter von 800-1.000 Rads an die Tiere nach Herstellerangaben (Beispiele hier gezeigten Rads 980). </li><li> Zurück Tiere in ihre Käfige für mindestens 4 Stunden ruhen. </li><li> Wählen Spendertieren der entsprechenden Genotyp (siehe 2A), als die Quelle der Mark-Vorläuferzellen. HINWEIS: Die entsprechenden Spender sind Tiere, die verschiedene linienspezifischen fluoreszierenden Reporter von dem Host zu verschiedenen Zellpopulationen oder eine des gleichen Genotyps als Kontrollen zu identifizieren. </li><li> Füllen einer Petrischale mit 70% Alkohol, und eine zweite Schale mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medien und einer 40 um Zellsieb in den Medien eingeweicht. Füllen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen mit RPMI-Medium. Halten Sie die Gerichte und Röhrchen auf Eis. </li><li> Opfern die Spendertiere von CO 2 Ersticken gemäß gültiger Richtlinien. Reinigen Sie die Haut und das Fell durch Einweichen der gesamten Tier mit 70% Ethanol bis alle Fell nass ist. </li><li> Entfernen Sie die skin vom unteren Hälfte des Tieres durch Schneiden um den mittleren Teil und ziehen die Haut nach unten über die Hinterbeine, um die Beinmuskulatur vollständig freizulegen. </li><li> Entfernen Sie die Tibia durch vordere Überdehnung im Kniegelenk, um den Knochen verrenken, dann mit einer sterilen Pinzette und Schere, schälen und Muskeln von beiden Enden der Tibia. Legen Sie die Knochen in der Petrischale mit Alkohol für bis zu 30 Sekunden, dann Transfer zum Zellsieb in der Petrischale mit den Medien. </li><li> Verrücken das Hüftgelenk und abziehen, die Muskeln auf den Oberschenkelknochen befestigt, platziert den Oberschenkelknochen kurz in Alkohol und dann legen Sie sie in der gleichen Zelle Sieb in der Schüssel. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze, verwenden sterilen Schere abzuschneiden beide Enden der Knochen und legen Sie eine 21-Gauge-Nadel auf einer 1-ml-Spritze in das Ende des Knochens. Spülen Sie die Mark in den 15-ml-Erlen mit Medien. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Knochen. </li><li> Verwendung der Rückseite des Kolbens aus einer 3 ml-Spritze endet Stauch Knochen in der ZellSieb auf der Petrischale mehrere Zellen zu extrahieren. </li><li> Setzen Sie den Filter auf einem 50 ml konischen Röhrchen und übertragen Sie Medien mit abgesaugt Zellen aus dem 15 ml konischen Röhrchen. Benutzen Sie die Rückseite des Kolbens, um das Mark, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, zu zerschlagen. Die 15 ml konischen Röhrchen, Knochenfragmente und die Zelle-Sieb mit 30 ml Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen waschen. </li><li> Zentrifugiere die Zellen 5 min bei 500 × g Zellen zu pelletieren. </li><li> Lyse der roten Blutzellen, die mit 2 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer für 2 min. Quenche die Lysepuffer mit 10 ml Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum. Bei 500 xg für 5 bis 10 min zu pelletieren. </li><li> Wasche die Zellen einmal in 10 ml RPMI-Medium und zweimal in Kochsalzlösung, Zentrifugieren bei 500 × g für 5-10 Minuten für jeden Waschvorgang zu pelletieren. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 3 x 10 6 Zellen in 200 ul Kochsalzlösung. </li><li> Über 3 x 10 6 Markszellen über die Schwanzvene Injektion in irradiated Empfängermäuse. </li><li> Zeigen angesäuertem Wasser (pH 3,0) in den Empfänger Käfig und lassen Mäusen zu erholen. HINWEIS: Mäuse, die die Transplantation wird innerhalb von 10-14 Tagen nach dem Eingriff zu sterben scheitern. </li><li> Nach 8 Wochen überprüfen Mark Rekonstitution durch die Untersuchung des peripheren Blutes Immunzellen mittels Durchflusszytometrie (2B-C). </li></ol> 3. Rücken Spalte Quetschverletzung HINWEIS: Wählen Sie die entsprechende Chimäre Tiere oder Doppel transgene Tiere für die Operation auf der Grundlage des gewünschten Experiments. Tiere entweder mit der Bezeichnung ansässig oder Knochenmark-Zellen wurden in vorherigen Schritten erstellt. <ol><li> Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Rongeure, Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten Gewebe, Nadeltreiber und Wundklammern. </li><li> Bereiten Medikamente den Mäusen Schmerzkontrolle zu verabreichen. Bupernex und Marcain werden üblicherweise zur Schmerzkontrolle verwendet. Verwenden Sie geeignete Medikamente wie erforderlich einnd von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. </li><li> Induzieren Anästhesie mit 4% Isofluran und halten mit 1-2% Isofluran, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro min zu erreichen. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres bis zur Trockenheit unter Narkose zu verhindern, und bestätigen Sie fehlende Reaktion zu Fuß Prise. Pflegen Sie die Temperatur mit einem Heizkissen und die Temperatur mit einem rektale Sonde überwachen. </li><li> Rasieren Sie die Rückseite der Maus mit einem elektrischen Rasierer über die gezielte Rückenmarksebene und dann dreimal Wischen Sie die Fläche mit PVP-Jod, gefolgt von zweimal mit 70% igem Alkohol. Legen Sie das Tier auf einem sterilen Tuch und decken das Tier mit einem anderen sterilen Tuch mit einem Loch an einem geeigneten Ort, um die Operationsstelle zu visualisieren geschnitten. Behalten Sie alle Tools auf sterilen Tüchern in der gesamten Operation. </li><li> Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie an der gewünschten Rückenebene mit Iris Schere, um die Muskeln auf der Rückseite des Tieres aus. </li><li> Unter einem dissektierender Mikroskop, schneiden Sie die Rückenmuskulatur, einschließlich des Trapezius und der Bänder des großen Rückenmuskeln entlang der Mittellinie, wo sie auf die Rückendornfortsätze anzuhängen, und setzen die Wirbelsäule. </li><li> Entfernen Sie die Rotatoren zwischen den dorsalen und Querfortsätze der Wirbelkörper, um die Schicht des spezifischen Wirbel offenbaren entfernt werden (T11 in diesem Fall). Identifizieren T11 durch das Einsetzen der letzten nicht-schwimmende Rippe auf diesen Prozess. </li><li> Legen Spitzen Rongeure in den Raum über und unter dem Prozess entfernt und leicht anheben, um sicherzustellen, dass sie sicher an ihrem Platz auf der Wirbel Lamina aber nicht zu tief, um die Wirbelsäule verletzen. Schließen Rongeure in einer Bewegung, die Lamina zu entfernen. </li><li> Vergrößern Sie die Laminektomie, wie mit Hilfe der Knochenzangen, um kleine Teile des Restwirbel zu entfernen benötigt. </li><li> Messen Sie 1 mm von den Spitzen einer Pinzette # 4 von gegen einen Herrscher hielt sie und Markieren mit einem wasserfesten Stift. Messen Sie ein 1 mm in Trennung Wetteschen den beiden Zinken durch Halten der Zange gegen den Herrscher und befestigen Sie die maximale Breite der Spitzen bis 1 mm, indem ein Gummiring Zange in Position über die Welle der Zange. </li><li> Erstellung einer kleinen Öffnung durch den Einsatz eines 30-Gauge-Nadel durch die Dura an den beiden Punkten für die Zinken der Zange, um auf die Wirbelsäule. </li><li> Legen der Zange Zinken in einem 90 ° Winkel zu der Dura durch die Löcher bis zu einer Tiefe von 1 mm an den Seiten der Zange markiert, so dass der Filter über der Dura. Klemmen Sie die Zange schließen und halten Sie für 10 Sekunden. Mitteilung, und wiederholen Sie die Zange quetschen zwei weitere Male für insgesamt drei hält. Pinzette entfernen aus dem Rückenmark. </li><li> Genießen Sie ein Stück absorbierbarer Gelatineschwamm komprimiert in Kochsalzlösung und über den Verletzungsstelle. </li><li> Mit einer Laufstich, Naht der Muskel anstelle über die Laminektomie und getränkt Gelatineschwamm mit # 4 synthetische nicht resorbierbares Nahtmaterial aus Nylon. </li><li> Clip der Haut an Ort und Stelle mit 5 mm gewickelt clips. </li><li> Injizieren 10 ul Marcaine (1,0 mg / kg) in 490 &amp; mgr; l Kochsalzlösung subkutan um die Inzisionsstelle und 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulär in den Glutealmuskulatur. </li><li> Lassen Tier an einem warmen Pad erholen und Monitor für alle bei der Bewegung oder Lähmungserscheinungen in den hinteren Gliedmaßen. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Verwenden Sie keine Tiere, die beobachtbare motorische Defizite anzuzeigen. HINWEIS: Dieses Gedränge Läsion kann auf jeder Ebene entlang des Rückenmarks durchgeführt werden, praktisch, T10-L4 stellen weniger technischen Herausforderungen für die Bildgebung in Bezug auf die Atmung und die Stabilisierung Körperbewegung mit Schellen. Clamp Platzierung muss um den Brustkorb bei Brust Ebenen geändert werden, um Bild. </li></ol> 4. Intravital Imaging <ol><li> Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten von Gewebe, Nadel dFlüsse und Wundklammern. </li><li> Betäuben die Maus nach wie vor mit Isofluran. Induzieren Anästhesie bei 4-5% und pflegen bei 1-2% je nach Bedarf, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro Minute und ein Mangel an Reaktion auf Fuß Prise halten. Halten Sie die Maus beheizt, überwachen Atemfrequenz, wenn nicht die Abbildung und Tier Temperatur mit einem rektale Sonde kontinuierlich zu überwachen. </li><li> Reinigen Sie die Haut um die Wundklammern mit Betadine und Alkohol und entfernen Sie die Wundklammern nach Herstelleranweisungen. Sobald Wundklammern entfernt werden, entfernen Sie die Haare mit Nair bei Bedarf und reinigen Sie die Website erneut mit PVP-Jod und 70% Alkohol. </li><li> Wiederaufnahme der Haut mit einer Schere. Nehmen Sie die restlichen Nähte von Muskeln und ziehen Muskeln heraus mit Zangen, Schneiden mit der Schere, wenn nötig. </li><li> Unter einem Präpariermikroskop Erstellen Taschen für das Rückenmark Klemmen durch Schneiden des Muskels mit einer Schere an der Seite der Querfortsätze an dem Wirbel eines Wirbelhöhe oberhalb und unterhalb der laminectomy. </li><li> Zeigen Klammern um jede dieser Wirbel und festziehen. Nach Bedarf einzustellen, um Raum für Mikroskopobjektiv zu ermöglichen, die das Rückenmark zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark parallel zur Imaging-Plattform ist, und Gewebestabilität für die Bildgebung zu halten. Bei Atem Artefakt gesehen, stellen Klemmen entsprechend auf Bewegung im Bildfeld zu minimieren. </li><li> Decken Sie die Klemmen mit Parafilm. </li><li> Entfernen Sie die absorbierbarer Gelatine komprimierte Schwamm aus dem Rückenmark mit einer Pinzette vorsichtig Abgreifen so viele Teile wie möglich, auch das Entfernen so viel von Narbengewebe in den Meningen, wie möglich. Abdeckung ausgesetzt Rückenmark mit Kochsalzlösung und neuen Schwamm, wenn nötig. HINWEIS: Wenn eine Blutung auftritt von der umgebenden Muskeln, entweder überzeugter mit Schwamm oder ausbrennen, wie gebraucht. , Nehmen Sie jedoch darauf, dass das Rückenmark mit dem Brenneisen berühren. Decken Sie das Rückenmark entweder mit einem Stück feuchten Gewebe oder Gelatine Schwamm zusammengedrückt, wenn Ausbrennen. </li><li> Erstellen Sie eine well, um die Immersionsflüssigkeit durch erste Abdichtung der Haut und des Gewebes mit Vetbond und dann mit Zahnacryl den Aufbau einer gut zwischen den beiden Klemmen des Rückenmarks Halter und den Seiten des Tieres zu halten. Warten Sie, bis die Acryl Kuren. </li><li> Füllen Sie das auch mit künstlichen Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) und klicken Sie hier für eine Blutung auf der Operationsstelle. </li><li> Gegebenenfalls zu diesem Zeitpunkt einzuspritzen fluoreszierenden Gefäß Farbstoffe intravenös durch Injektion in die Schwanzvene, die Blutgefäße bei der Bildgebung zu markieren. HINWEIS: Fluorescent Dextran über 70 kDa wird häufig verwendet, wenn auch Quantenpunkte und fluoreszenzmarkierte Lektine als nützlich Schiff Farbstoffe dienen auch. 50 ul von 150.000 WM TRITC-Dextran wird typischerweise intravenös injiziert. </li><li> Physiologisch relevanten Immunzellbeweglichkeit zu erhalten, muss die Temperatur der Maus bei 37 ° C gehalten werden. Bewegen Sie die Maus auf eine Temperatur kontrollierten Umgebung unter dem Mikroskop für die Bildgebung und Überwachung des Tier korrekte anesThesia Niveau von Atemfrequenz und Fuß Prise. Überwachen Sie das Tier häufig während der Bilderzeugung zu bestimmen, der Narkosetiefe, mit dem Ziel, eine Atemfrequenz von 60 zu erreichen - 100 Atemzüge pro Minute. </li><li> Suchen Sie die Bildstelle durch das Mikroskop-Okular. </li><li> Stellen Sie die 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um ein Bild Z-Stapel jede 30-60 Sekunden dauern, um dynamische Bilddaten zu erhalten. </li><li> Sobald Bildgebungssitzung abgeschlossen ist entfernen Sie das Tier von der beheizten Box. </li><li> Lösen Sie die Rückenklammern und entfernen Sie die Maus von den Klemmen. Ziehen Sie die Acryl gut von der Haut weg, während das Entfernen der Klemmen. </li><li> Wenn die Maus wieder abgebildet werden, legen Sie Kochsalzlösung getränkt Gelatine Druck Schwamm über das Rückenmark. Schließen Sie die Muskeln und Haut über der Operationsstelle. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere während der Genesung von Anästhesie. Wenn das Tier zeigt keine Anzeichen von neurologischen Defizit nach der Wiederherstellung, sollte das Tier eingeschläfert werden. Andernfalls einschläferndie Maus in einem CO 2 Kammer, bevor sie aus der Narkose tritt nach IACUC genehmigten Sterbehilfe-Protokoll. </li><li> Analysieren Fluoreszenzbilder mit Bildanalyse-Software, indem Sie den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Imaging Wechselwirkungen verschiedener Zelltypen in ihrer Mutter Gewebekompartimente beim anschließenden Pathologie in Echtzeit hat großes Interesse erzeugt. Innerhalb des dichten Netz des ZNS, Zell-Zell-Kontakt und Signalisierung mit benachbarten Zellen essentiell für die normale Funktion und zum Verständnis ZNS-Pathologie. Hier haben wir beschrieben, die Verwendung von 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie für die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb einer mechanischen Verletzung des Rückenmarks. Neben der Qualität der Chirurgie und Gewebepräparat, ist die mechanische Stabilität des Gewebes von größter Bedeutung für eine erfolgreiche Zeitraffer-Mikroskopie, insbesondere der Isolierung des Rückenmarks von Atembewegungsartefakte. Die Stabilität kann durch die Suche nach Bewegung des Rückenmarks unter einem Präpariermikroskop, die der Herzfrequenz oder Atem des Tieres entspricht beurteilen. Stabilität zu beurteilen ist sowohl während der Durchführung der Operation und auch unmittelbar vor Beginn der Bildgebung. Wenn der Animal nicht stabil ist, ist es angezeigt, die Platzierung und die Dichtheit der Rückenmark Klemmen erfolgen. Zelltyp-spezifische fluoreszierende Reportermausmodelle in Verbindung mit Knochenmark-Chimäre Ansätze haben die Identifizierung von monozytischen Zellen gegenüber Mikroglia und Axone erlaubt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Blut gewonnen Monozyten und Mikroglia sind nicht für die Sekundär axonalen Schäden nach Trauma mit Hilfe der hier 43 beschriebenen Methodik verantwortlich. Dextran konjugierten Schiff Farbstoff ermöglicht die Ermittlung von Schiffen sowohl Sehenswürdigkeiten zuleiten und Verletzungen der Gefäßintegrität zu identifizieren. Die Auswahl des geeigneten fluoreszierenden Reportermausmodell ist kritisch, damit die richtige Identifizierung der gewünschten Zelltypen, die abgebildet werden. Entwicklung von Fluoreszenzmausmodelle, die für die Studien geeigneten unternommen sind auch entscheidend für den Erfolg von Experimenten. Die Unterscheidung zwischen den beiden Populationen von phagozytischen CX3CR1 + / GFP </sup&gt; Zellen im ZNS ist traditionell schwierig. Wie hier gezeigt ist, kann eine gemeinsame immunologische Technik, Bestrahlung Chimären verwendet werden, um strahlungsresistent, ZNS-residenten Mikrogliazellen aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen unterscheiden. Die Bestrahlungsverfahren hat das Potenzial, die Blut-Hirn-Schranke schädigt, ändern Zellphänotypen, so Verwendung dieses Modells sollte sorgfältig geprüft werden. Das Ausmaß dieser Veränderungen unterscheidet sich mit Bestrahlungsdosis sowie Dauer der Erholungsphase, und ihre Auswirkungen auf verschiedene Entzündungsmodellen noch nicht vollständig untersucht. Die Wirkungen der Bestrahlung auf CNS Blut-Hirn-Schranke kann durch Abschirmung des Kopfes während der Bestrahlung zu minimieren, und dies hat sich gezeigt, dass die Zellinfiltration in das Rückenmark nach der Bestrahlung zu verringern, auch wenn das Rückenmark nicht direkt abgeschirmte 52. Hier haben wir beobachtet, dass die Anzahl von Zellen infiltriert in das ZNS im stationären Zustand als Ergebnis der Chimäre Generation unbedeutend ist im Gegensatz zu den taubener von Zellen in die Läsion. Andere alternative Modelle zu berücksichtigen sind Arzneimittel-induzierter Chimären 52 oder parabiotic Mausmodellen 53. Hier haben wir eine bestimmte, einfache und reproduzierbare geringe Verletzungsmodell, das in einer Läsion an der dorsalen weißen Substanz des Rückenmarks, die einfach zu Bild unter Verwendung der 2-Photonen-Mikroskopie ist Ergebnisse präsentiert. Dieses Verfahren stellt auch einen messbaren Läsionen um den Grad der axonalen Sterben in der dorsalen Säulen, die in der Literatur mit komplementären festen Gewebeanalyse 16,18,43,48,54 gekoppelt testen. In diesem Modell, Tiere zeigen nur geringe Defizite und benötigen keine besondere Pflege nach der Verletzung. Zukünftige Studien unter Verwendung der hier beschriebenen dorsalen Säule Quetschverletzung und bildgebenden Verfahren können leistungsfähige Screening-Tools, um die Wirksamkeit der Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu beurteilen. Diese Behandlungen können niedermolekularen Inhibitoren, Drogen, Zellprodukte, Gewebetransplantate und kombinatorische Behandlung schließens. Das Zusammenspiel von Makrophagen, Mikroglia und Neuronen sind wahrscheinlich auch eine Rolle bei anderen Krankheitsmodellen im Rückenmark, einschließlich multipler Sklerose, Tumoren, Meningitis und amyotrophe Lateralsklerose spielen, und diese Technik kann bei der Untersuchung dieser Erkrankungen sowie sein .

Die Entzündungsreaktion auf einer Erkrankung oder Verletzung im zentralen Nervensystem (ZNS) ist wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Wechselwirkungen zwischen Immun- und residenten Zellen innerhalb des Gewebes. Untersuchungen dieser zellulären Interaktionen im Rückenmark sind von besonderem Interesse in dem lebenden Tier. Der einzige leicht zugänglich CNS weiße Substanz-Trakt ist im dorsalen Säulen der Wirbelsäule, so dass dies ein wichtiges Gebiet, auf dem sich auf die Verbesserung machbar experimentellen Ansatz konzentrieren. Diese Untersuchungen haben aufgrund der technischen Schwierigkeiten beim Zugang zu und zur Stabilisierung des ZNS für die Bildgebung begrenzt. Live-Bildgebung im Rückenmark wurde in einer Verletzung des Rückenmarks über ein paar Stunden nach der ersten Beleidigung beschrieben zuvor 1-13, jedoch nur wenige Studien haben angesprochen Zellbewegung. Die traumatische Querschnittlähmung ist eine komplexe Umgebung, mit Neuronen, Astrozyten, Fibroblasten, NG2 Vorläuferzellen und Immunzellen including Mikroglia, Neutrophilen, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen 14,15. Makrophagen sind die Teilmenge der Immunzellen für die Phagozytose in der Läsion verantwortlich Infiltrieren aus der Zirkulation. Die Rolle dieser phagozytischen Zellen ist diskutiert worden, mit Berichten hervorgeht, dass diese Zellen sowohl schädlich und Schutzrollen in das verletzte Gewebe zu nehmen. Diese Rollen reichen von steigenden sekundären axonalen Sterben nach einer Verletzung und in einer Art und Weise phagozytischen 16-22 handeln, die Annahme auf einer Wundheilungs Phänotyp und abnehmende Funktionsdefizite in der verletzte Tier 21,23,24. Zuvor versucht, Makrophagen von Mikroglia in erster Linie auf die Morphologie in gesundem Gewebe verlassen zu unterscheiden. , Aktivierte Mikroglia und Makrophagen exprimieren jedoch viele der gleichen Markierungen und Anzeige unterscheiden Morphologie nach einer Verletzung 25-29, so dass die Trennung der verschiedenen Aktivitäten dieser Zellen schwer zu studieren based auf diese Faktoren allein 30. Diese Zellen können durch differentielle Expression von CD45 mit Durchflusszytometrie 33,34 getrennt werden, wobei diese Vorgehensweise ist bei der Unterscheidung dieser Zelltypen in vivo weniger nützlich. Verwendung differentielle Expression von CCR2 und CX3CR1 Mikroglia und Makrophagen wurde ebenfalls untersucht, obwohl die dynamischen Veränderungen in der Expression dieser Marker Monozyten differenzieren sich zu Makrophagen genaue Analyse 35,36 erschweren. Mikroglia sind die Immunzellen Wohnsitz im ZNS und ergeben sich aus Dottersack Vorläuferzellen während der fetalen Entwicklung, während Makrophagen aus Knochenmarksvorläuferzellen abgeleitet und geben Sie den verletzten ZNS nach einer Beleidigung 31,32. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung von Morphologie, diese beiden Zelltypen zu unterscheiden, ist das Knochenmark mit Vorläufern von einem Spendertier ersetzen exprimieren eine nachweisbare Markierung in die Makrophagen aus den Donor-Vorläufer abgeleitet ist, unter Beibehaltung des CNS resident, recipabler abgeleitete Mikroglia. Diese Knochenmarks chimären Modelle sind allgemein bei vielen anderen Anwendungen 37-40 verwendet. Dieses Verfahren hat eindeutige Einschränkungen mit Verletzung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch Bestrahlung oder zytotoxische Medikamente zur Markvorläuferzellen zu beseitigen im Wirt, wodurch seine Verwendung in bestimmten Applikationen Begrenzungs verursacht sind. In letzter Zeit werden funktionale Unterschiede zwischen Mikroglia und Makrophagen im zentralen Nervensystem beginnen, mit Hilfe der Durchflusszytometrie, Gen-Chip-Array-Analyse und Chimärismus Methoden 24,26,41-44, die sehr nützlich in der Zukunft erweisen wird erkennbar. Obwohl die Trennung dieser beiden Zelltypen schwierig bleibt, ist das Verständnis ihrer einzigartigen Funktionen, die zu zielgerichteten Behandlungs von Erkrankungen, die sowohl Mikroglia und Makrophagen im ZNS beteiligt wichtig. Beschreibung von zellulären Wechselwirkungen innerhalb der Läsion des Rückenmarks wurde hauptsächlich aus Untersuchungen, die Zellkultur-Modellen kommen. Dies ist due auf die Herausforderungen, mit bildgebe sowohl der Querschnittlähmung und Immunzellen zusammen in einem lebenden Tier beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Rückenmarksverletzungen von unterschiedlicher Art und Schwere sind Prellung Modelle 45,46, Pin-Stichverletzungen 2, Platzwunde 47 und die hier beschriebenen 16,18,48 dorsalen Säule Quetschverletzungen. Entzündung in der Hirnhaut steigt mit der Schwere der Verletzung und stellt besondere Herausforderungen für die Implantation von Fenstern oder Operationen für serielle Bildgebung. Einige dieser Herausforderungen sind: die Infiltration von Phagozyten als auch die Erzeugung von Fasergewebe über der Operationsstelle. Einige dieser Probleme können durch die Schaffung von kleineren Läsionen und für den freiliegenden Rückenmark mit nicht immunogen Wundversorgung zwischen Dura und den paraspinous Muskeln, um die spätere Wiedereröffnung der Operation ermöglichen überwunden werden, wie hier getan wird, um die Hinterstrang Quetschverletzung studieren . Die Fähigkeit, Bild nur die dorsale Teil des Spin-al Kabel begrenzt auch die Wahl der Verletzung, da Prellung Modelle in erster Linie verursachen Schäden am Zentralstecker, oft Schonung der meisten dorsalen Teil der Hinterstränge, insbesondere zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung 45,49. Daher beschreiben wir eine einfache Verletzungsmodell, das eine saubere, wiederholbare, rechteckig geformte Läsionen, die für sowohl die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb der Verletzung, und für eine einfache Quantifizierung von axonalen Position relativ zu der Läsion ergibt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:125px;">Name</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:240px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">CX3CR1 GFP mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">5582</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Thy-1 YFP H mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">3782</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Mouse pie cage</td>
			<td style="width:165px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:64px;">MPC 2 set</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">60mm2 petri dish</td>
			<td style="width:165px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">430166</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Falcon 40 um cell filter</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">08-771-1</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:125px;">1x15mL and 1x50mL conical tube</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">16 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305177</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">309628</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">A10492-01</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">1E+07</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:125px;">RPMI media</td>
			<td rowspan="2" style="width:165px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">R8758</td>
			<td rowspan="2" style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">F4/80 antibody</td>
			<td style="width:165px;">Ebioscience</td>
			<td style="width:64px;">12-4801 PE</td>
			<td style="width:240px;">For FACS verification of chimeras</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30-gauge insulin syringe&#160;</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">328280</td>
			<td style="width:240px;">For tail vein injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Spinal Cord Clamps</td>
			<td style="width:165px;">Narshinge</td>
			<td style="width:64px;">STS-A</td>
			<td style="width:240px;">For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic powder&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1320</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1404</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Gelfoam gelatin sponges</td>
			<td style="width:165px;">Pfizer</td>
			<td style="width:64px;">9E+06</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">4-0 Ethilon sutures</td>
			<td style="width:165px;">Ethilon</td>
			<td style="width:64px;">1667G</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Reflex Clips, 7mm</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS750344</td>
			<td style="width:240px;">For surgery. Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">14061-09</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">45/5 Forceps, Dumoxel</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11251-35</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">16021-14</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305106</td>
			<td style="width:240px;">For making access holes in dura</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Forceps Dumont #4 Biology tips</td>
			<td style="width:165px;">Dumont</td>
			<td style="width:64px;">11242-40</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Needle Drivers</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12002-12</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Michel Wound Clip Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS700753</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Wound clip remover</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12033-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">O-rings for Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11200-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Cordless Rechargable Animal trimmer</td>
			<td style="width:165px;">Wahl</td>
			<td style="width:64px;">Series 8900</td>
			<td style="width:240px;">for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Vetbond</td>
			<td style="width:165px;">3M</td>
			<td style="width:64px;">1469SB</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td>
			<td style="width:165px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:64px;">NDC 67618-150-08</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Nair Hair remover lotion</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td style="width:64px;">NRSL-22329-05</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:165px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:64px;">NDC 11695-6776-2</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Marcaine</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">6E+06</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Bupernex</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">121-7793</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="345" rowspan="6" style="height:345px;width:125px;">aCSF</td>
			<td rowspan="6" style="width:165px;">Chemicals from Sigma</td>
			<td style="width:64px;">119 mm NaCl</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:64px;">26.2 mM NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">From Cold Spring Harbor Protocols</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:64px;">2.5 mM KCl</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:64px;">1 mM NaH2PO4</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:64px;">1.3 mM MgCl2</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">10 mM glucose&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">TRITC-dextran 150,000 MW</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">T1287</td>
			<td style="width:240px;">For intravenous administration to label vasculature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Eine schematische Darstellung der dorsalen Säule Stauch Läsion ist in 1A gezeigt. Nach der Läsion wird das Tier hergestellt und intravitale Mikroskopie mit spinalen Klammern (1B) stabilisiert. Ein Bild unmittelbar nach der dorsalen Säule Quetschverletzung genommen wird, zeigt eine deutlich sichtbare rechteckigen Läsion mit einer Pinzette Zinken Einfügepunkte, die eindeutig identifizierbar sind. Axone an der Verletzungsstelle sind über die Spannweite der gesamten hinteren Säule (1C) durchtrennt wird. Die Integrität von Blutgefäßen erhalten bleibt und keine Hinweise auf eine Gefäß Austritt von Farbstoff wurde durch Fluoreszenz detektiert. Zur Serienbild der gleichen Läsion über Wochen durchzuführen, können die Muskeln und die Haut über der Laminektomie aus dem Wieder Exposition genäht werden. Ähnliche Läsion Morphologie zu späteren Zeitpunkten (1D, E) ersichtlich. 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen noch sichtbar, aber die Läsion hat damit begonnen, in der Größe d erhöhenue zu Sekundärschäden durch eine Entzündung verursacht. Die Axone am kaudalen Ende der Läsion wurden aus dem anfänglichen Ort der Verletzung durch ein Verfahren namens &quot;axonale Absterben&quot; eingefahren. Die Axone im rostralen Ende der Läsion zeigte Wallerian artigen Degeneration (1D, E). Zwischen den Tagen 5 und 22 nach der Verletzung, die Größe der Läsion stabilisiert. Gleichzeitig kann ein großer Zustrom von CX3CR1 + Zellen beobachtet Infiltrieren in und um die Stauch Läsion während dieser Zeitpunkte werden, obgleich die Identität dieser Zellen (Mikroglia gegen Makrophagen) nicht bei der Herstellung, wie in Figur 1 gezeigt unterscheidet. Um das Verhalten von Mikroglia und Makrophagen im Gedränge Läsion Mikroumgebung zu unterscheiden, wurde eine Strahlungs Chimäre Modell verwendet (in 2A beschrieben). Zuerst werden die Knochenmarksvorläuferzellen eines CX3CR1 + / GFP-Maus mit nicht-fluoreszierenden Donor-cel ausgetauschtls, also nur GFP + CNS fremde Mikrogliazellen sind durch Fluoreszenz-Bildgebung sichtbar. Die Effizienz des Mark Rekonstitution mittels Durchflusszytometrie Prüfung des peripheren Blutes 8 Wochen nach Marktransplantation (Abbildung 2B, C) ​​bestätigt werden. In 2B F4 / 80 und GFP-positive Makrophagen, in blau, in einem CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimären Maus erkannt wird, in dem einige GFP negativ, aber F4 / 80 positive Monozyten sind ebenfalls vorhanden. In 2C ohne doppelte positive F4 / 80 und GFP-positive Zellen sind nach dem Austausch CX3CR1 + / GFP Empfängerknochenmark mit Wildtyp-Knochenmark verlassen. Vor Verletzungen, sind Mikroglia gleichmäßig im Rückenmark verteilt Anzeigen eines ruhenden, verzweigten Morphologie (Figur 2D). 8 Tage nach Verletzung, kann nur ein paar Mikrogliazellen in und um die Läsion nachweisbar. Diese Mikrogliazellen zeigen eine amoeboid Morphologie (2E). Zweitens KnochenMark-Vorläuferzellen in einer nicht-fluoreszierenden Maus werden durch Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus ersetzt daher Rendering-Knochenmark stamm CX3CR1 + Monozyten / Makrophagen durch GFP-Fluoreszenz sichtbar ist (2A). Vor der Verletzung, die nur GFP + Zellen nachgewiesen sind weitgehend perivaskuläre, von denen berichtet wurde, um sein Knochenmark und ständig umdrehen regelmäßig 28 (2F). Nach Quetschverletzung kann CX3CR1 + / GFP Zellen entlang der Innenseite der Blutgefäße rund um die Läsion (2H-J) zu sehen ist, und die Läsion Zentrum ist mit infiltrierenden CX3CR1 + / GFP Makrophagen (2G) gefüllt. Zeitraffer-Aufnahme der dorsalen Säulen können für bis zu 6 Stunden durchgeführt werden. In Figur 3 wird gezeigt, eine nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus unmittelbar nach der Verletzung in dem Zellen aus dem Kreislauf zu sehen sein kannn Auszug aus dem Blutgefäß zu der Läsion Kern und die innerhalb der Verletzungsstelle (3A, B; Supplemental Film 1). Die Bildanalyse unter Verwendung der Fluoreszenzintensität um Zellen zu identifizieren können die Pfade durch Makrophagen (3A, B; Supplemental Film 1) genommen zu verfolgen. Statistik von der Bildanalyse abgeleitet zeigen die durchschnittliche Beweglichkeit der Makrophagen in der Läsion ist 3,6 um / min (3D). Schließlich wird bei 22 Tage nach der Verletzung, Axonen, Mikroglia und Makrophagen, kann innerhalb der Läsion zeigt den Bereich der Bildgebung detektiert werden soll über lange Zeiträume (Supplementary Movie 2) stabil. <img alt="Figur 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: Aufbau und sequentielle Bildgebung des dorsalen Säule Quetschverletzungen. (A) Die RückenSpalte Quetschverletzung wird durch Entfernen der Dornfort des Wirbels auf der Ebene von Interesse durchgeführt. Zangen sind in den dorsalen Säule des Rückenmarks 1 mm voneinander eingesetzt und werden dann geschlossen 3 mal um den in lila dargestellt Läsion zu erzeugen. (B) Das Tier wird dann mit Rückenmark positioniert Schellen, um die Stabilität für intravital Bildgebung zu erhalten. (C) Unmittelbar nach der Verletzung, kann die Zange Insertionsstellen (rot oval) und der rechteckige Quetschverletzung Volumen (graue Box) eindeutig identifiziert werden. Axone in den dorsalen Wurzeln zu sehen ist (weiße Pfeile) sowie die verletzten Enden der Axone auf der kaudalen Seite der Läsion (gefüllte Pfeilköpfe). (D) 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen (rot oval ), und das Ausmaß der Läsion (grauer Kasten) noch leicht sichtbar gemacht werden. Die Läsion hat sich seit der ersten Beleidigung zu. Axone unterziehen Waller artigen Degeneration kann rostral zur Läsion (offene Pfeilspitzen) in additi sehenauf, um Axone in den hinteren Wurzeln (weiße Pfeile) und die Enden der verletzten Axone (weiße Pfeilspitzen). (E) 22 Tage nach der Verletzung, ist die Läsion noch erkennbar mit ähnlichen Abmessungen der Verletzung nach 5 Tagen. Achten Sie auf die große Anzahl von CX3CR1 + Zellen in und um die verletzte Stelle. Funktionen beschriftet sind die gleichen wie in (D). Alle Maßstabsbalken = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2: Aufbau von chimären Mäusen CX3CR1 + / GFP-exprimierenden CNS fremde Mikrogliazellen oder Knochenmark-abgeleitete Makrophagen in der dorsalen Säule verknallt Läsion zu verfolgen. (A) Eine schematische Darstellung des chimären Mäusen Erzeugung mit entweder CX3CR1 + / GFP exprimierenden microglia oder Makrophagen. Zuerst werden Thy-1 YFP H Mäusen bestrahlt und das Knochenmark wird mit Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus isoliert rekonstituiert, was zu einer chimären Maus, deren Makrophagen GFP +. Zweitens sind Thy-1 YFP H / CX3CR1 + / GFP-Mäuse bestrahlt und das Knochenmark wird mit Markzellen von einem nicht-fluoreszierenden Maus isoliert rekonstituiert, wodurch eine chimäre Maus, deren Mikroglia GFP +. (B) Beispiel eines Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in das Blut von einem chimären Tiers mit einem CX3CR1 + / GFP Markspender in einem bestrahlten C57BL / 6-Empfänger transplantiert. Zellen aus den CX3CR1 positiven Spendern, die positiv für sowohl GFP und F4 / 80 abgeleitet werden gezeigt in der blau unterlegt Bereich. (C) Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in einem chimären Tier mit einem C57BL6 Spendermark in eine ir transplantiertabgestrahlte CX3CR1 + / GFP Empfänger. Beachten Sie das Fehlen von Doppel-positive CX3CR1 + / GFP und F4 / 80 Zellen innerhalb der blaue markierte Bereich. (D) Ein Intravital Zwei-Photonen-mikroskopische Momentaufnahme einer Maus aus dem ersten chimären Schema und zeigt GFP + Mikroglia mit verzweigten Morphologie im Rücken Spalte (Pfeilspitze). Diese Zellen werden unter Axone (gelb) in der Hinterwurzel und der dorsalen Säule durchsetzt. Balken = 100 um. (E) Intravital Imaging der gleichen Maus in (B) von 8 Tagen nach dorsalen Säule Verletzungen offenbart ein paar CX3CR1 + Mikroglia mit großen und amoeboid förmigen Zellkörper, die ohne Verfahren (Pfeilspitze) sind. Balken = 100 um. (F) Snapshot einer Maus aus der zweiten chimären Schema in (A) und zeigt kaum GFP + Makrophagen, im ZNS Parenchym. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (G) Intra Abbildung der gleichen Maus (F) 8 Tage nach der dorsalen Säule Schädigung zeigt alArge Zustrom von Makrophagen in und um die Läsion. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (H) eine höhere Vergrößerung Bild CX3CR1 + Blut abgeleiteten Zellen in Kontakt mit den Behältern in der unversehrten Tier. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m. (I) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, aus dem Inneren des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 30 &amp; mgr; m. (J) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, von außerhalb des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3 :. Vertreter Zell Tracking-Daten in einem nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus sofort nach dorsalen Säule verknalltVerletzung. Von den CX3CR1 + Zellen in (A) genommen (A) Eine Momentaufnahme der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen rund beschädigt Axone (gelb) von Zusatz Film 1 unmittelbar nach einem dorsalen Säule Quetschverletzungen. (B) Die Wege (grau) in einem 110 min Intravital Imaging-Sitzung. (C) Eine Zeit codierte Darstellung der Tracks in (B). Spuren sind auf der Grundlage ihrer Zeit innerhalb der gesamten 110 Minuten Film gefärbt, wie in dem Zeitbalken angezeigt. (D) Histogramm der Gesamtbeweglichkeit der CX3CR1 + Zellen. Alle Maßstabsbalken sind 30 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Ergänzende Film 1: Vertreter Intravital Film unmittelbar nach dem dorsalen Säule Quetschverletzung im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + <strong&gt; / CX3CR1 GFP / + Maus. Intravitalrücken Bildgebung wurde unmittelbar nach einer dorsalen Säule Quetschverletzungen an T11-Ebene durchgeführt. Rechte Bild zeigt die Bewegung der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen. Die Wege der Bewegung der Zellen werden als weiße Spuren auf der linken Seite gezeigt. Die Verletzung an der oberen linken Ecke. CX3CR1 + Zellen, in Reise in die Stelle der Verletzung entlang dieser Spuren werden. Axone sind in gelb dargestellt. Maßstabsbalken = 40 um. Gesamtzeit: 110 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 300x. Ergänzende Movie 2:. Vertreter Intravital Film bei 22 Tagen nach dorsalen Säule verknallt Läsion im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + Maus Abgebildet ist ein Vertreter Film in einer Maus 22 Tage nach der ersten dorsalen Säule verknallt genommen Verletzungen am Rückenebene T11. Die injry ist an der oberen rechten Ecke des Rahmens befinden. Axone (gelb) aufsteigend rostral werden unten rechts angezeigt. Die Dorsalvene und Blutgefäße sind mit TRITC-Dextran (rot) gekennzeichnet. CX3CR1 + Zellen innerhalb der Verletzung, bewegen sich mit einer geringeren Geschwindigkeit verglichen mit denen unmittelbar nach der Verletzung. Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. Gesamtzeit: 90 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 600x.

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Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Serie: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Advanced Diffusion Imaging im Hippocampus von Ratten mit leichter traumatischer Hirnverletzung

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Induktion von diffusen axonalen Hirnverletzungen bei Ratten basierend auf Rotationsbeschleunigung

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...