Unser Protokoll beschreibt die Verwendung eines Wasserstoffperoxid-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven. Dieses Protokoll wird den Forschern helfen, die Rolle reaktiver Sauerstoffspezies in der normalen Physiologie und Pathophysiologie zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der Echtzeit-Nachweis von Wasserstoffperoxid in lebenden Tieren und kultivierten Zellen.
Diese Methode kann auf andere Tiere angewendet werden, wie z.B. das Nagetiermodellsystem. Um die Coverlips vorzubereiten, verwenden Sie säuregereinigte Coverlips, die in 100% Ethanol gelagert sind. Verwenden Sie eine Wende, um einen Abdeckr aus dem Aufbewahrungsbehälter zu entfernen, und flammen Sie ihn auf, um Ethanolreste zu entfernen.
Trocknen Sie den Abdeckr vollständig an der Luft, indem Sie ihn schräg in eine 35-Millimeter-Kulturschale legen. Bereiten Sie Poly-D-Lysin oder PDL oder Arbeitslösung vor. Tragen Sie PDL auf die Mitte jedes Coverlips auf, vermeiden Sie eine Ausbreitung der Lösung auf die Kanten und inkubieren Sie die PDL für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Stellen Sie sicher, dass die PDL nicht austrocknet. Waschen Sie die PDL mit 0,5 Millilitern sterilem Wasser und lassen Sie die Platten vollständig trocknen. Bereiten Sie Laminin Arbeitslösung vor.
Und tragen Sie es auf die Mitte jedes Coverlips auf, um die Ausbreitung der Lösung auf die Kanten zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator für zwei bis sechs Stunden, vermeiden Sie eine Trocknung der Lamininlösung. Um eine Embryodissektion in Platten-Netzhautganglienzellen oder RGCs durchzuführen, bereiten Sie vier 35-Millimeter-Gewebekulturschalen vor, etikettieren sie und füllen Sie sie mit vier Millilitern 70% Ethanol.
E2 Media eins. E2 Medien zwei. Und E2 Medien drei, am Tag der Sezierung.
Bewahren Sie das Geschirr im Kühlschrank auf. Wenn Zebrafischembryonen 34 Stunden nach der Befruchtung sind, nehmen Sie die mit Laminin beschichteten Kulturschalen aus dem Inkubator. Und waschen Sie den Bezug dreimal mit 0,5 Millilitern 1X PBS.
Nach der endgültigen Wäsche vier Milliliter ZFCM+media in jede Kulturschale geben. Vermeiden Sie das Trocknen der Platte. Holen Sie die vorbereiteten gekühlten Kulturgerichte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausgleichen.
Füllen Sie vier bis sechs PCR-Röhrchen mit 15 Mikrolitern ZFCM+media. Holen Sie Zebrafischembryonen aus dem Inkubator und tauchen Sie die Embryonen für 5-10 Sekunden in eine 35-Millimeter-Gewebekulturschale mit 70% Ethanol, um sie zu sterilisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pipettentransfer auf das E2-Medium in einer Schüssel, die sterile E2-Medien enthält, um überschüssiges Ethanol abzuwaschen.
Dann übertragen Sie die Embryonen auf die E2-Medien zwei Schalen und entfernen Sie ihre Chorionen mit einer scharfen Zette. Schließlich übertragen Sie embryonen auf die E2-Medien drei Schalen, um Dissektionen durchzuführen. Positionieren und halten Sie die Embryonen mit einer der Zangen mit einer der Zangen vor dem Eigelb.
Und entfernen Sie den Schwanz hinter dem Dottersack mit der anderen Zette. Schnappen Sie sich den Hals mit einer Zette und nehmen Sie den Kopf ab, um das Gehirn und die Augen dem E2-Medium auszusetzen. Rollen Sie mit der Spitze einer feinen Zette sanft die Augen vom Kopf ab, während Sie das Schädelgewebe mit einer zweiten Zette nach unten halten.
Vier Augen in eines der zuvor vorbereiteten Röhrchen geben, die ZFCM+Gently triturate mit einer p20-Pipette etwa 45 Mal auf und ab, um Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie das ZFCM+ mit den dissoziierten Zellen in die Mitte der Abdeckungsrutsche. Halten Sie Kulturen auf der Tischplatte bei 22 Grad Celsius auf einem Polystyrolschaumgestell, um Vibrationen zu absorbieren.
Überprüfen Sie am Tag der Bildgebung die Zellen unter dem Mikroskop, um das Wachstum von RGC-Axonen zu validieren. Für die Lebendzellbildgebung übertragen Sie die Coverlips von der Kulturschale in eine Lebendzellbildgebungskammer. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, das mit einem DIC-Objektiv OG-590 Longpass-Rotfilter und einer EMCCD-Kamera ausgestattet ist.
Ersetzen Sie vor der Bildgebung das ZFCM+medium durch ZFCM-Nachdem Sie die Zellen mit dem 10X-Objektiv positioniert haben, erfassen Sie Bilder mit 60-facher Vergrößerung mit einem Ölimmersionsobjektiv. Verwenden Sie eine zusätzliche 1,5-fache Vergrößerung. Erfassen Sie zunächst DIC-Bilder.
Stellen Sie dann roGFP2-Orp1 mit dem entsprechenden Filterset dar. Nachdem Sie den ersten Satz von Bildern genommen haben, tauschen Sie Medien mit Medien aus, die verschiedene Behandlungslösungen enthalten. Die Medien sollten alle 30 Minuten der Bildgebung gewechselt werden, um pH- und Osmolaritätsänderungen zu vermeiden.
Für die In-vivo-Bildgebung 22 bis 24 Stunden nach der Befruchtung Embryonen in E3-Medien aufbewahren, die 0,003% Phenylthioharnstoff ohne Methylenblau enthalten. Tauschen Sie täglich Medien aus und entfernen Sie tote Embryonen. Im gewünschten Alter embryonieren und montieren Sie Embryonen in 1% Agarose auf 35 Millimeter Glasbodenkulturschalen.
Embryonen können dorsal, ventral oder seitlich ausgerichtet sein, abhängig von der Region, die für die Bildgebung von Interesse ist. Nachdem die Agarose erstarrt ist, füllen Sie das Geschirr mit E3-Medien ohne Methylenblau, aber mit 0,016% Tricain. Stellen Sie das Mikroskop für die Bildgebung auf.
Verwenden Sie ein invertiertes laserscannendes konfokales Mikroskop, um Embryonen abbilden, die auf dem Boden eines Agarosetropfens montiert sind. Regen Sie roGFP2-Orp1 an und erfassen Sie entsprechende Bilder mit den gewünschten Emissionsfiltern. Erwerben Sie Z-Stacks mit einer Schnittstärke von fünf Mikrometern durch den gewünschten Teil der Embryonen.
Nach der Bildgebung embryonieren Sie mit einer feinen Zette aus Agarose und halten sie im Inkubator und methylenblauen freien Medien mit Phenylthioharnstoff bis zum gewünschten Alter. Ein repräsentatives Bild des Wasserstoffperoxid-Biosensors und der kultivierten Zebrafisch-RGC-verlängerten Axone ist hier zu sehen. Zellkörper, Axon und Wachstumskegel sind in einzelnen Neuronen deutlich sichtbar.
Die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu den Nährmedien erhöht die Verhältniswerte und zeigt, dass mit diesem System Veränderungen in Echtzeit erkannt werden können. Die Quantifizierung des Wasserstoffperoxidgehalts wird in Panel-B.To Bestimmung des Wasserstoffperoxidgehalts in ganzen Zebrafischembryonen gezeigt, die mRNA wurde während der einzelligen Phase injiziert, wodurch alle Gewebe den roGFP2-Orp1-Biosensor exprimieren. Die Kopfregion von Zebrafischlarven wird zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gezeigt, wobei der Schwerpunkt auf dem Wasserstoffperoxidgehalt in der Netzhaut liegt.
Die Basalwerte von Wasserstoffperoxid in den Zebrafischembryonen wurden zwei Tage nach der Befruchtung und fünf Tage nach der Befruchtung gemessen. An zwei Tagen nach der Befruchtung waren die Verhältniswerte signifikant niedriger als an fünf Tagen nach der Befruchtung. Darüber hinaus zeigte jedes Tier einen unterschiedlichen Anstieg seines retinalen Wasserstoffperoxidgehalts.
Die Verwendung einer feinen Zette zum Entfernen der Augen und eine sanfte Dissoziation der Augen mit der Pipette sind die kritischsten Schritte bei diesem Verfahren. Diesem Protokoll können medikamentöse Behandlungen folgen, um die Faktoren zu untersuchen, die an der ROS-Signalisierung beteiligt sind.
